DNA FINGERPRINTING

DNA FINGERPRINTING

OBIETTIVO:  Confrontare le dimensioni dei frammenti di DNA generati dalla digestione enzimatica di plasmidi diversi, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie di ciascun individuo.

MATERIALI USATI: provette, pipette (0,5-l0 μL; 10-l00 μL;100-l000 μL), DNA di tre individui (nel nostro caso DAN plasmidico per questioni di gestibilità), enzima (EcoRI), cofattore (Mg²⁺), incubatrice, centrifuga, loading-dye (blu di bromofenolo, xylene-cianolo, glicerolo), agarosio, TBE, cella elettroforetica, colorante (Bromuro di Etidio)

Pur facendo parte di una stessa specie, organismi differenti posseggono particolari sequenze di DNA (in zone dette loci ipervariabili) che sono diverse da individuo ad individuo (a parte nei gemelli). Questa proprietà permette di confrontare in modo univoco due o più campioni di materiale genetico. Questa caratteristica del DNA è sfruttata, ad esempio, nei test di maternità, in campo forense o per altri scopi in cui sia necessario rapportare DNA di individui diversi. Queste analisi possono anche essere fatte su larga scala, per fare studi a riguardo dell'identità genetica di una popolazione (screening).

Con questa tecnica, si sfrutta la capacità degli enzimi di restrizione di formare segmenti di lunghezza differente. Questo è possibile perché la sequenza di riconoscimento che attiva gli enzimi di restrizione viene trovata, in individui diversi, dopo una serie differente di basi azotate. Questa proprietà è utilizzata anche per determinare malattie genetiche legate a particolari marcatori genici (RFLP) che allungano (o accorciano) le basi intercorrenti fra due sequenze di riconoscimento del medesimo enzima di restrizione. Aggiungendo degli enzimi di restrizione a materiale genetico, proveniente da plasmidi, DNA o RNA, questi ne fanno segmenti di varia lunghezza.

Se i segmenti risultanti vengono posti in una cella elettroforetica subiranno un'attrazione proporzionale alla loro carica. Tuttavia i segmenti più lunghi, pur essendo attratti con più forza, subiscono una resistenza maggiore: il gel impedisce loro di muoversi e andare verso il polo di carica opposta. I segmenti di DNA, che erano caricati negativamente (grazie all'ambiente basico della soluzione in cui si trovavano), si dispongono in lunghezza decrescen-te dal polo negativo al polo positivo. Successivamente, per rendere possibile la visualizzazione delle varie bande formatisi, il gel viene colorato con Bromuro di Etidio, un colorante che si inserisce nella doppia elica e che è fluorescente ai raggi UV. Possiamo così vedere le varie bande che si sono formate. Un esempio è qui di fianco.

Per confronto si nota che la prima colonna corrisponde alla quarta. Con ragionevole sicurezza possiamo dire che la prima e la quarta colonna sono il risultato di un campioni di DNA dello stesso individuo.

PREPARAZIONE DELLA CELLA ELETTROFORETICA

I campioni di Dna precedentemente preparati (con LD, vedi Protocollo)sono posti nella cella elettroforetica. Essa consiste in una vaschetta con due elettrodi alle estremità, nel mezzo della quale vi è l'alloggiamento per una lastrina quadrata (circa 5mm di spessore e 7cm di lato) di gel. Tutto questo è immerso in una soluzione di TBE. Il TBE è una soluzione tampone a pH 8; questo ambiente rende il DNA carico negativamente ed in grado dunque di essere attirato dal polo positivo. TBE sta per TRIS (un gruppo di composti), Acido Borico (HBO₂) ed EDTA (etilen di-ammino tetra acetico). Il gel è composto di acqua distillata e agaribosio (0,8% in peso), uno zucchero che a questa concentrazione crea una matrice, una sorta di rete, che gelifica la soluzione.

:Il DNA fingerprinting si svolge secondo questo protocollo:

Si prelevano 10 μL di DNA campione da analizzare di ciascuno individuo

Si aggiungono ad ogni provetta 5 μL di enzima di restrizione EcoR1

Si aggiungono 5 μL di cofattore (soluzione di Mg²⁺ che attiva l'enzima)

Si incuba per 30-45 min a 37°C per permettere all'enzima di agire efficacemente

Ai campioni viene aggiunta una soluzione detta Loading-Dye. Essa è formata da:

o   Colorante Violetto (leggero): blu di bromofenolo

o   Colorante Blu    (pesante): xylene-cianolo

o   Glicerolo: rende pesante la soluzione e ne evita la dispersione nella cella elettroforetica

Nei vari pozzetti della cella elettroforetica, vengono posti 10 μL di ogni campione

Viene fatta la "corsa elettroforetica", durante la quale i segmenti si distanziano. Questa corsa viene fatta applicando un voltaggio di 130 V e dura circa 30 min

Colorazione con Bromuro di Etidio

Confronto