GLI ACIDI NUCLEICI, I CROMOSOMI, LA CROMATINA, IL CICLO CELLUARE, DUPLICAZIONE DEL DNA

GLI ACIDI NUCLEICI

Tutti gli organismi contengono acidi nucleici sotto forma di acido deossiribonucleico (DNA) e ribonucleico (RNA)

Il DNA è il depositario dell'informazione genetica che viene trascritta (cioè copiata) in molecole di RNA. L'RNA contiene il codice per sintetizzare specifiche proteine.

Una molecola acido nucleico è un polimero costituito da monomeri detti nucleotidi. Ciascun nucleotide è costituito da tre molecole:

1. uno zucchero pentoso
2. una base azotata
3. una molecola di acido fosforico

Uno zucchero pentoso è uno zucchero la cui molecola è costituita da 5 atomi di carbonio. La base azotata è legata al carbonio 1 dello zucchero pentoso, mentre l'acido fosforico (H₃PO₄) è legato al carbonio 5 che è esterno all'anello dello zucchero.

I nucleotidi si legano tra loro medianti legami fosfodiestere che collegano il C3 del pentoso di un nucleotide al C5 del nucleotide successivo. In questo modo l'acido fosforico impiega due dei suoi tre gruppi acidi nel legame fosfodiestere 3-5. il gruppo acido restante conferisce alla molecola di acido nucleico particolari caratteristiche:

1. proprietà acide
2. capacità di legarsi con proteine basiche (istoni)
3. basofilia (la molecola può essere facilmente colorata con coloranti basici)

Lo zucchero pentoso è il ribosio nell'RNA e il deossiribosio nel DNA. La differenza tra i due è che al deossiribosio manca l'ossigeno legato al C2.

Le basi azotate si chiamano così perché contengono molti atomi di azoto e possono essere di due tipi: purine o pirimidine

BASI AZOTATE

I nucleotidi che costituiscono la molecola del DNA sono:

1. adenosin monofosfato
2. citidin monofosfato
3. guanosin monofosfato
4. timidin monofosfato

Quelli che costituiscono la molecola dell'RNA sono gli stessi, ad eccezione del timidin monofosfato che è sostituito dall'uridin monofosfato.

Un nucleoside è un nucleotide a cui manca il fosfato, cioè sono la combinazione di uno zucchero pentoso e di una base azotata. Per esempio, è un nucleoside l'adenosina:

Adenina → base azotata

Adenosina → nucleoside (adenina + zucchero pentoso)

Adenosin monofosfato → nucleotide (adenina + zucchero pentoso + fosfato)

L'adenosin trifosfato (ATP) è un particolare nucleotide con tre acidi fosforici, uniti tra loro con legami ad alto contenuto energetico. Infatti questa è una molecola fondamentale per la cellula perché rappresenta la principale forma di accumulo di energia.

La molecola di DNA è costituita da 2 catene polinucleotidiche le quali formano una doppia elica intorno allo stesso asse centrale. Esse sono antiparallele: i legami 3-5 fosfodiestere sono rivolti in direzione opposta. Questo vuol dire che se una catena inizia con il C3 libero e finisce con il C5 libero, l'altra catena è disposta in modo contrario.

Le due catene sono unite tra loro mediante legami a idrogeno che si instaurano tra le basi complementari. Le uniche coppie tra le quali è possibile il legame sono A-T e C-G.

Tra A e T si instaurano due legami a idrogeno mentre tra C e G se ne formano tre, quindi la coppia C-G è più stabile.

A=T   C≡G

La sequenza assiale di basi lungo una catena può variare molto, ma la sequenza della catena corrispondente deve essere complementare alla prima.

Le due catene possono essere separate tra loro rompendo il legame a idrogeno tra le coppie di basi. Questo può essere fatto mediante riscaldamento o un pH alcalino (fusione o denaturazione). Dopo la denaturazione si può riottenere la conformazione a doppia elica lasciando raffreddare lentamente il DNA, in modo che le badi possano riappaiarsi (rinaturazione)

La struttura dell'RNA è simile a quella del DNA, tranne che per la presenza del ribosio invece del deossiribosio e dell'uracile invece della timina. Inoltre L'RNA è costituito da una catena singola.

Ma le molecole di RNA, avendo estese regioni complementari all'interno di una stessa catena, spesso si ripiegano e tra le basi della catena si instaurano legami a idrogeno, formando delle anse a forcina.

Ci sono tre tipi di RNA:

1. RNA messaggero (mRNA): porta l'informazione genetica per la sequenza di amminoacidi
2. RNA transfer (tRNA): identifica e trasporta gli amminoacidi ai ribosomi
3. RNA ribosomico (rRNA): rappresenta il 50% della massa dei ribosomi

LA CROMATINA

Nelle cellule degli eucarioti il DNA non è libero ma associato a piccole proteine dette istoni, in un complesso chiamato cromatina. Esistono cinque tipi differenti di istoni, tutti di natura basica. Per questo motivo possono instaurare uno stretto legame con il DNA, di natura acida.

I quattro istoni principali, H2A, H2B, H3 e H4 hanno ciascuno una composizione simile anche nelle specie più diverse, mentre l'istone H1 è differente da specie a specie.

La cromatina può presentare vari livelli di organizzazione:

• Aspetto moniliforme: si presenta come un filo di perle, cioè come una serie di perle spesse 10 nm e collegate tra loro da un filamento di DNA. L'aspetto moniliforme non rispecchia la vera struttura della cromatina, ma è un artefatto di tecnica, in cui viene eliminato l'istone H1. Si osserva quando la cromatina viene trattata per essere studiata al  microscopio elettronico
• Fibra di 10 nm: con trattamenti meno drastici è stato osservato che la cromatina si presenta come una fibra di 10 nm in cui sono presenti delle unità ripetitive a stretto contato tra loro, dette nucleosomi. In ogni nucleosoma i quattro istoni H2A, H2B, H3 e H4 sono disposti in ottameri contenenti due molecole di ciascuna proteina attorno ai quali vi si avvolge il DNA, all'esterno. I nucleosomi sono a stretto contatto tra di loro e sono localizzati a intervalli di 200 coppie di basi di DNA. L'istone H1 si trova tra un nucleosoma e l'altro. Nella fibra di 10 nm la catena di DNA da 5 a 7 volte più compatta rispetto all'aspetto moniliforme, ma ancora 1000 volte meno rispetto ai cromosomi metafasici
• Fibra spessa: ha diametro variabile tra 20 e 30 nm e rappresenta la probabile struttura della fibra inattiva. Si forma in seguito all'avvolgimento della fibra di 10 nm in un solenoide. Il DNA raggiunge una compattezza pari a 40 volte quella iniziale, e per raggiungere la compattezza di un cromosoma metafasico deve ripiegarsi ancora un centinaio di volte

I CROMOSOMI

Nel corso della divisione cellulare la cromatina si condensa a formare i cromosomi, i quali sono circa 40.000 volte più densi della fibra di 10 nm. Essi sono strutture bastoncellari che servono a poter distribuire equamente il DNA tra le cellule lie. I componenti dei cromosomi sono 4:

CROMATIDI alla metafase ciascun cromosoma risulta formato da due strutture simmetriche, i cromatidi, contenenti ognuna un'unica molecola di DNA. Essi sono esattamente uguali (cromatidi fratelli) e sono uniti fra loro a livello del centromero

CENTROMERO è la regione di attacco degli elementi del fuso mitotico sul cromosoma. È situato in un tratto più sottile del cromosoma detto costrizione primaria

TELOMERO estremità dei cromosomi contenenti l'inizio e la fine della molecola di DNA che costituisce il cromatidio

ORGANIZZATORE NUCLEOLARE  si trovano in alcuni cromosomi che presentano costrizioni secondarie in cui ci sono regioni contenenti i geni che inducono la formazione del nucleolo

TEORIA UNINEMICA: ciascun cromatidio rappresenta un'unica molecola lineare di DNA con le proteine ad essa associate

I cromosomi vengono classificati in quattro tipi a seconda della forma determinata dalla posizione del centromero:

1. METACENTRICI il centromero è posto a metà dei cromatidi e quindi le braccia sono uguali
2. SUBMETACENTRICI le braccia sono di lunghezza differente
3. ACROCENTRICI presentano un braccio cortissimo dove si trova la costrizione secondaria all'estremità della quale c'è una regione sferoidale detta satellite
4. TELOCENTRICI il centromero è posto ad un estremo

La cromatina si condensa nel corso della mitosi e si decondensa alla telofase. Ma ci sono alcune regioni dei cromosomi che non si decondensano e rimangono compatte anche durante l'interfase. Queste regioni vengono chiamate eterocromatine, mentre le altre eucromatina.

Nell'eterocramatina il DNA è molto denso e si presenta in forma di fibra di 20-30 nm cioè si tratta di DNA inattivo.

L'esempio più noto è quello della coppia di cromosomi X nelle femmine dei mammiferi: uno dei due cromosomi è attivo e rimane eucromatico mentre l'altro è inattivo e costituisce il corpo di Barr nell'interfase.

Un altro esempio è quello del gatto di Sna. Questo esemplare presenta un mantello a macchie nere e arancioni (a placche di tartaruga), ma solo le femmine. Questo perché la macchiatura un gene contenuto nel cromosoma X diventa eterocromatico e non attivo in alcuni gruppi di cellule e non in altri. In stadi precoci dell'embriogenesi, in ogni cellula della femmina di mammifero uno dei cromosomi X diventa inattivo a caso, di conseguenza nell'adulto si forma un mosaico in cui il 50% di cellule hanno un cromosoma X attivo di origine paterna e l'altro 50% un cromosoma X attivo di origine materna

IL CICLO CELLUARE

Una cellula in accrescimento presenta un ciclo cellulare che consiste essenzialmente in due periodi: l'interfase e la divisione. L'interfase presenta tre periodi che vengono chiamati fase G1,S e G2.

• Fase G1: la cellula raddoppia le sue dimensioni e aumentano di numero organuli e molecole organiche
• Fase S: avviene la duplicazione del DNA
• Fase G2: vengono prodotte le strutture necessarie alla divisione cellulare, la cromatina inizia a spiralizzarsi
• Mitosi: avvine la divisione cellulare

Duplicazione del DNA

La duplicazione del DNA avviene nella fase S (sintesi) del ciclo cellulare d'ogni cellula.

La replicazione del DNA è semi-conservativa: questo significa che ogni molecola lia contiene una catena parentale e una neo sintetizzata.

Il primo passo verso la replicazione semi-conservativa è la separazione delle due catene complementari nel punto in cui deve cominciare la replicazione; in modo che ciascuna catena sia libera di fungere da stampo per la polimerizzazione di una nuova catena complementare. La polimerizzazione è catalizzata dall'enzima DNApolimerasi; che seleziona i deossinucleotidi trifosfati (d-ATP, d-TTP, d-GTP, d-CTP) e li lega uno dopo l'altro con legame fosfodiestere 3'-5'. L'enzima lega il fosfato presente su un deossinucleotide trifosfato al gruppo OH legato al carbonio 3' del deossiribosio appartenente al nucleotide terminale della catena in crescita. Nella reazione i due gruppi fosfati terminali si staccano sotto forma di pirofosfato.

La DNApolimerasi catalizza solo l'allungamento unidirezionale di una catena, cioè può aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3' ma non all'estremità 5'. La DNApolimerasi può catalizzare l'aggiunta di nucleotidi all'estremità 3' di una catena esistente ma non è in grado di iniziare una nuova catena. Per iniziarla è, infatti, necessario un innesco o primer cui aggiungere (all'estremità 3') i nucleotidi in sequenza. Nella cellula fa da innesco una breve catena di RNA. L'innesco è sintetizzato come segue:

prima avviene una dissociazione circoscritta delle due catene su un tratto interno alla molecola di DNA

un enzima detto primasi catalizza la formazione di una breve catena di RNA a partire da ribonucleotidi trifosfati (ATP, UTP, CTP, GTP) [la primasi a differenza della DNApolimerasi è capace di dare inizio ad una catena]

l'innesco di RNA resta appaiato allo stampo, poi arriva la DNApolimerasi che estende la catena per aggiunta di deossinucleotidi all'innesco

naturalmente si forma un innesco su ciascuna catena parentale e i due inneschi hanno polarità opposta e quindi le due catene lie crescono in direzioni opposte

man mano che le catene lie si estendono alla loro estremità 3' la doppia elica si apre a cerniera in entrambe le direzioni

il punto di rotolamento dell'elica si chiama forcella replicativi

man mano che la forcella avanza lascia dietro di se una zona a singolo filamento su ciascuna delle catene parentali. A questo punto si formano nuovi inneschi che sono poi prolungati per riempire a ritroso le parti non replicate delle catene parentali

gli inneschi sono poi rimossi quando i frammenti sintetizzati indietro (Okazaki) incontrano l'estremità 5' dell'innesco del tratto precedente. Quando avviene l'incontro la DNApolimerasi stacca uno dopo l'altro i nucleotidi dell'innesco e aggiunge simultaneamente deossinucleotidi

quando tutto l'innesco è stato rimosso le due estremità sono unite dalla DNAligasi

Nella replicazione del DNA bisogna considerare il problema che la separazione delle due catene richiede la despiralizzazione della doppia elica. La doppia elica fa un giro completo ogni 10 paia di basi. Quindi ogni 10 basi separate e svolte a livello della forcella replicativa, la doppia elica a valle deve fare un giro in direzione opposta.

In E.coli la forcella si apre alla V=60000 paia di basi al minuto, il che richiederebbe che la doppia elica a valle facesse 6000 giri al minuto (negli eucarioti la V è 10 volte inferiore). La rotazione di tutto il DNA a valle della forcella è bloccato dalle numerose proteine associate perciò in mancanza di rotazione, la torsione della doppia elica a valle ostacolerebbe la despiralizzazione e impedirebbe la replicazione. Il problema è stato risolto grazie all'enzima topoisomerasi che crea rotture transitorie in un singolo filamento a breve distanza dalla forcella replicativa. Queste rotture si creano e si riparano rapidamente ad opera della stessa topoisomerasi.