NUCLEOTIDI E ACIDI NUCLEICI

NUCLEOTIDI E ACIDI NUCLEICI

Gli acidi nucleici (DNA e RNA) sono macromolecole ad alta informazione che permettono a ciascuna cellula di costruire le proteine delle quali necessita. Gli acidi nucleici hanno pesi molecolari compresi fra 25.000 e diversi milioni e sono costituiti da unità chiamate nucleotidi; ognuna di queste è formata da un gruppo fosfato, un pentoso ed una struttura ciclica detta base azotata. Diversi nucleotidi si possono ritrovare anche non riuniti in acidi nucleici, ma liberi nel cellule - NUCLEO, CITOPLASMA, RIBOSOMI, PARETE CELLULARE, CAPPARATO DI GOLGI, ITOSCHELETRO, APPARATO DI GOLGI" class="text">citoplasma e con funzioni biologiche differenti.

L'acido deossiribonucleico (DNA) è costituito da deossiribonucleotidi formati da un deossiribosio, un gruppo fosfato e una fra le seguenti basi azotate: adenina, guanina, citosina e timina, mentre l'acido ribonucleico (RNA) è costituito da ribonucleotidi formati da un ribosio, un gruppo fosfato ed una fra le seguenti basi azotate: adenina, guanina, citosina e uracile. Il deossiribosio è un pentoso che differisce dal ribosio per l'assenza di un atomo di ossigeno. Il DNA ha una struttura costituita da due catene avvolte ad elica (αelica), mentre l'RNA è costituito da un'unica catena. Le basi azotate sono gruppi eterociclici derivanti dalla purina (con due anelli) e dalla pirimidina (con un solo anello): adenina e guanina sono basi puriniche, timina, uracile e citosina sono basi pirimidiniche.

Lo studio degli acidi nucleici è stato sempre associato a quello delle proteine e l'itinerario delle ricerche che hanno portato alla conoscenza dettagliata della struttura e funzionalità degli acidi nucleici è passato attraverso le tappe seguenti:

a) dapprima si è verificato che i cromosomi erano costituiti da DNA e proteine (senza poter stabilire quale di queste due componenti trasmettevano i caratteri ereditari);

b) si è poi supposta l'esistenza di un gene per ogni enzima e successivamente di un gene per ogni proteina (esperimenti di Beadle e Tatum);

c) si è verificato che il DNA delle cellule somatiche era in quantità doppia rispetto a quello delle cellule 'sessuali';

d) si è verificato che la percentuale di adenina è circa uguale a quella della timina e quella della citosina è circa uguale a quella della guanina (regola di Chargaff, cfr. Tab. 7) e che le proporzioni tra basi puriniche e pirimidiniche variano da specie a specie;

e) si è scoperto che nelle infezioni di virus batteriofagi solo il DNA virale penetra nella cellula parassitata e induce la formazione completa di particelle virali.

Venne stabilito che i caratteri strutturali del DNA dovevano soddisfare le esigenze di:

a) trasportare informazione genetica da cellula a cellula e da generazione a generazione;

b) copiare se stesso nel corso di ogni divisione cellulare;

c) essere soggetto a mutazioni (errori) che dovevano essere copiate;

d) poter leggere l'informazione e tradurla (sotto forma di proteine) nell'individuo.

Tab. 7 -Percentuali delle basi azotate nel DNA umano

Wilkins e Franklin dimostrarono nel DNA la regolare ripetitività di singole unità disposte ad αelica e distanti fra loro 2 nm. Watson e Crick, radunando tutti i dati a disposizione, senza effettuare alcun esperimento, proposero e verificarono con la diffrazione ai raggi X il famoso modello a doppia elica che valse loro il premio Nobel. Poichè la distanza di 2 nm (20 Å) era eccessiva per l'accoppiamento di due basi puriniche e troppo ridotta per l'accoppiamento di due basi pirimidiniche, tenuto conto della regola di Chargaff, l'accoppiamento non poteva che essere fra una base purinica ed una pirimidinica. In base alla struttura delle basi azotate si verificò che si possono formare tre legami H fra C e G e due legami H fra A e T; che ogni base azotata è legata al deossiribosio a formare un

deossiribonucleoside e che i carboni 3 e 5 di due deossiribonucleosidi adiacenti sono collegati per mezzo del gruppo fosforico con un legame fosfodiestere in una lunga catena. Venne altresì verificato che le due catene complementari sono antiparallele con una estremità 3' contrapposta ad una estremità 5', ovvero alla stessa estremità di una molecola di DNA una catena ha il carbonio in posizione 3 del deossiribosio libero mentre l'altra ha libero il carbonio in posizione 5. Il passo della doppia elica, cioè la distanza tra due punti con la medesima posizione spaziale è di 3,4 nm, mentre ogni nucleotide dista da quello adiacente 0,34 nm ed è ruotato di 36° così che in una spira completa vi sono 10 coppie di deossiribonucleotidi. La sequenza delle basi azotate può essere quanto mai varia, considerando che nel corredo genetico di un virus vi sono circa 5.000 paia di basi, in quello del mais circa 7 miliardi e in quello dell'uomo circa 3 miliardi. In soluzione, il riscaldamento a circa 95 °C porta alla separazione dei due filamenti (denaturazione) del DNA, ma un successivo rapido raffreddamento può determinare il riassemblamento della doppia elica (rinaturazione); nella cellula la separazione dei due filamenti può avvenire grazie all'enzima DNApolimerasi. Filamenti singoli di DNA possono ritrovarsi normalmente in natura solo in piccoli virus.

Il DNA ha la possibilità di replicarsi. La replicazione avviene con l'intervento della DNApolimerasi ed altri enzimi che rompono i legami H fra le basi appaiate separando i due filamenti complementari, ciascuno dei quali funge da stampo. Vengono utilizzati deossiribonucleotiditrifosfati liberi che si accoppiano opportunamente ai deossiribonucleotidi legati nei filamenti: per esempio il dATP si accoppia alla base T sul filamento, mentre il dCTP si accoppia, sempre sul filamento, alla base G. Il sistema enzimatico provvede poi a unire i singoli deossiribonucleotidi con legami fosfodiestere eliminando due gruppi fosforici che vengono rilasciati e idrolizzati. Poiché la sintesi di ogni nuovo filamento avviene partendo dalla posizione 3', nella replicazione la sintesi è continua su un solo filamento, mentre su quello opposto, antiparallelo, è irregolare, cioè avviene per frammenti successivamente legati. Alla fine della replicazione avremo due molecole di DNA identiche, ma ciascuna delle quali avrà un filamento completamente nuovo ed uno originario della molecola di partenza (duplicazione semiconservativa). Il DNA è confinato all'interno del nucleo nelle cellule più evolute, quelle degli eucarioti, mentre non lo è nelle cellule più primitive dei procarioti. Il DNA può essere colorato specificamente con la colorazione di Feulgen a base di fucsina; tale colorazione mette in evidenza la localizzazione del DNA stesso e la sua quantità nei diversi stadi del ciclo cellulare.

La produzione di proteine specifiche attraverso i processi di trascrizione e traduzione è mediata dall'RNA. Questo è particolarmente abbondante nelle cellule e nei siti cellulari ad alta attività di sintesi proteica. Strutturalmente l'RNA differisce dal DNA per il fatto di essere costituito da un solo filamento (rarissimamente due), per il tipo di zucchero (ribosio anzichè deossiribosio), per una base azotata (uracile anziché timina). Esistono almeno tre classi di RNA: l'RNA messaggero (mRNA), l'RNA di traferimento o transfer (tRNA) e l'RNA ribosomiale (rRNA). L'mRNA si forma nel nucleo utilizzando come stampo uno dei filamenti del DNA grazie all'enzima RNApolimerasi che polimerizza i ribonucleotiditrifosfati. Tale processo, chiamato trascrizione, inizia con la copiatura di un filamento del DNA in senso 5'→3' da un sito iniziatore (promotore) sino ad un sito terminatore, ma non avviene esattamente allo stesso modo nei procarioti e negli eucarioti. Nel nucleo di questi ultimi prima di arrivare alla sintesi del filamento definitivo dell'mRNA (che uscirà poi dal nucleo) vengono prodotti dei precursori contenenti porzioni provvisorie che vengono tagliate ed eliminate e porzioni che vengono invece 'cucite' insieme nel filamento finale con un meccanismo di riorganizzazione (processing). Queste reazioni avvengono all'interno del nucleo e solo il filamento definitivo dell'mRNA esce dal nucleo. I geni (sequenze di basi azotate) localizzati sul DNA che codificano le porzioni del precursore dell'mRNA che vengono tagliate ed eliminate nel processing sono chiamati introni, mentre quelli che codificano le porzioni che, riassemblate, fanno parte dell'mRNA definitivo vengono chiamati esoni. Il significato del processing, che riguarda anche la sintesi delle altre due classi di RNA, non è ancora del tutto chiaro; secondo alcuni autori potrebbe essere una risposta all'attacco da parte di acidi nucleici virali. La sequenza delle basi azotate dell'mRNA, derivante direttamente da quella del DNA, determina la sequenza degli amminoacidi

= 64 triplette diverse. Poiché gli amminoacidi sono solo 20, ogni amminoacido può essere codificato da più di una tripletta; in pratica esistono delle triplette sinonimo, formate da sequenze diverse di basi, che codificano lo stesso amminoacido: per esempio UUU e UUC codificano la fenilalanina; inoltre esistono alcune triplette (UAA, UAG e UGA), con significato di termine. Ogni tripletta sull'mRNA è chiamata codone; il gene pertanto è quella serie di triplette sul DNA che permette la trascrizione di una serie di codoni sull'mRNA che, attraverso un meccanismo di traduzione, determina l'assemblaggio della sequenza di amminoacidi di una proteina. Il linguaggio, con pochissime eccezioni, è universale in tutti gli esseri viventi e ciò ha permesso grandissimi sviluppi nella bioingegneria, per esempio l'inserimento di geni batterici in DNA di cellule eucariotiche e viceversa. nelle proteine. Esistono quindi due linguaggi, quello degli acidi nucleici fondato sulle basi azotate e quello delle proteine fondato sugli amminoacidi; il passaggio dal primo al secondo linguaggio richiede un processo di traduzione. Il linguaggio degli acidi nucleici è ormai noto da tempo; la sua decodificazione fu opera di Nieremberg che nei primi anni 60 utilizzò RNA artificiale, costituito da ripetizioni di un solo nucleotide (UUUUUUU, CCCCCC, AAAAA, ecc.) in omogeneizzati di cellule batteriche, ottenendo polipeptidi costituiti solo rispettivamente da fenilalanina, prolina o lisina. Successivamente, Khorana impiegò RNA artificiali più complessi e l'intero codice venne decifrato: una sequenza di tre basi azotate (tripletta) corrisponde ad un amminoacido: per esempio AUG codifica la metionina, CGA l'arginina e così via. Con quattro basi diverse, A, U, G e C, sono possibili 4³

L'RNA di trasferimento o tRNA è l'acido nucleico che traduce ciò che è scritto sul filamento di mRNA: ad ogni codone di questo corrisponde un anticodone sul tRNA. Esistono 64 tipi di tRNA, ognuno ha un peso molecolare di 23.000-30.000 ed è formato da un filamento di 80 ribonucleotidi ripiegato su se stesso con una conurazione caratteristica (a trifoglio con tre anse ed un 'gambo'), nella quale sono presenti nucleotidi con basi particolari che regolano la disposizione dei legami H, soprattutto tra le basi C e G, e nella quale sono evidenti due siti importanti: l'anticodone (tripletta complementare al codone dell'mRNA) nell'ansa centrale e l'accettore definito dalla tripletta CCA (punto d'attacco dell'amminoacido); si riconoscono inoltre due siti, dei quali uno, TΨC (ribotimidina+pseudoruridina+citosina), uguale per tutti i tRNA che interagisce col ribosoma ed un altro, DHU (diidrouridina), diverso per ogni tRNA, che attiva enzimi specifici per i legami con i diversi amminoacidi (amminoacil-tRNA sintetasi).

La traduzione avviene leggendo il filamento dell'mRNA con inizio dall'estremità 5' dove è presente una sequenza nucleotidica leader che determina l'attacco del filamento stesso ai ribosomi (vedi oltre) nella loro subunità minore provvista di due siti. I ribosomi 'scorrono' sul filamento leggendo i codoni (triplette); ad ogni tripletta si accoppia un tRNA provvisto del proprio amminoacido (amminoacil-tRNA). Ciò avviene in corrispondenza dei due siti del ribosoma così che due amminoacidi si trovano a contatto in corrispondenza della subunità maggiore e possono essere legati fra loro: grazie all'enzima peptidiltransferasi (che è parte integrante della subunità maggiore del ribosoma) si rompe il legame tra il primo amminoacido e il primo tRNA e se ne forma uno peptidico tra i due amminoacidi. Il primo tRNA, liberatosi del proprio amminoacido, si stacca dalla tripletta sull'mRNA e lascia il ribosoma pronto a 'catturare' un altro amminoacido. A questo punto il ribosoma scivola in avanti sul filamento dell'mRNA muovendo così l'inizio della catena polipeptidica sul primo sito e lasciando disponibile il secondo sito per la lettura della successiva tripletta alla quale si attaccherà un altro amminoacil-tRNA complementare e così via sino alla lettura di una tripletta di termine. Una molecola di mRNA può essere letta da più ribosomi per volta (polisomi).

L'rRNA o RNA ribosomiale è costituito da molecole più piccole (peso molecolare compreso fra 550.000 e 110.000) associate a proteine e contenute nei ribosomi (tre nella subunità maggiore ed una in quella minore) ed è indispensabile per una corretta interazione fra mRNA e tRNA.

Quasi tutto il DNA degli eucarioti. come detto, è confinato nel nucleo, mentre tutte le forme di RNA sono sintetizzate nel nucleo (l'rRNA nel nucleolo) e poi liberate nel citoplasma. Esistono però

quantità minori di DNA localizzate in particolari organuli cellulari, in particolare nei mitocondri e nel cloroplasti.

I meccanismi di trascrizione e traduzione sono in realtà un po' più complicati. Per esempio non sempre viene trascritto un gene per volta, ma più spesso vengono trascritte delle unità di trascrizione chiamate operoni costituite da tre tipi di geni: il promotore (nel punto di inizio), l'operatore (che controlla la produzione dell'mRNA) ed i geni strutturali. La trascrizione può cessare allorchè un repressore si lega all'operatore. La trascrizione può comportare alcuni errori che possono a loro volta determinare mutazioni, ma esistono anche meccanismi di correzione: la DNA polimerasi può eliminare un nucleotide difettoso dalla posizione iniziale di un mRNA, altri enzimi, ligasi, riescono a sostituire nucleotidi difettosi anche all'interno della molecola.

Diversi nucleotidi esistono anche in forme indipendenti dagli acidi nucleici; si tratta soprattutto di nucleotidi utilizzati nei trasferimenti di energia: ATP (adenosintrifosfato), ADP (adenosindifosfato), AMP (adenosinmonofosfato), GTP (guanosintrifosfato), GDP (guanosindifosfato), NAD (nicotinamideadenindinucleotide), FAD (flavinadenosindinucleotide), ecc. L'ATP è considerato la 'principale moneta di scambio energetico' della cellula ed è costituito da adenina legata a ribosio, legato, a sua volta, a tre gruppi fosfati contenenti due legami ad alta energia. Il NAD è invece costituito da due nucleotidi legati fra loro: uno è formato da nicotinamide (una vitamina), ribosio e gruppo fosforico, l'altro da adenina, ribosio e gruppo fosforico.