Regolazione dell'espressione genica nei Procarioti

Operone

La trascrizione in ESCHERICHIA COLI ed in altri procarioti inizia quando l'enzima RNA-polimerasi aderisce al DNA in un sito specifico detto PROMOTORE. La molecola del RNA-polimerasi si lega al promotore e provoca l'apertura della doppia elica del DNA iniziando la trascrizione. Un segmento di DNA che codifica per un dato polipeptide è noto come GENE STRUTTURALE. Spesso, nel cromosoma batterico, i geni strutturali che codificano per polipeptidi con funzioni correlate si trovano in sequenza. Questi gruppi funzionali possono includere, per esempio, due catene polipeptidiche che insieme costituiscono un particolare enzima, oppure tre o più enzimi che lavorano in un'unica catena di reazioni chimiche. I gruppi di geni che codificano per queste molecole vengono in genere trascritti in un singolo filamento di RNA-messaggero. Così, un gruppo di polipeptidi necessari alla cellula nello stesso momento ed in uguale quantità, può essere sintetizzato contemporaneamente. Una cellula non produce tutte queste proteine in continuazione, ma solo quando queste sono necessarie e nel giusto quantitativo. Per esempio, le cellule di E. coli, che utilizzano il lattosio come alimento, necessitano dell'enzima ß-galattosidasi per scindere la molecola di lattosio, un disaccaride, nei suoi due monosaccaridi costituenti: il glucosio ed il galattosio. Solo in presenza del lattosio viene indotta la sintesi dell'enzima ß-galattosidasi. In un altro esempio l'E. coli sintetizza gli enzimi necessari alla biosintesi dell'aminoacido triptofano, solo se alle cellule non sia fornito dall'esterno l'aminoacido; se il triptofano è già presente, si blocca la sintesi degli enzimi sopra descritti.

OPERONE LAC

Secondo questo modello, un operone comprende: il PROMOTORE, uno o più GENI STRUTTURALI ed un'altra sequenza di DNA nota come OPERATORE.

OPERATORE: sequenza di nucleotidi posta tra il gene promotore ed i geni strutturali. La trascrizione dei geni strutturali è spesso controllata da un altro gene ancora: il REGOLATORE, che può trovarsi in qualsiasi punto del cromosoma batterico. Questo gene codifica per una proteina detta REPRESSORE, che si lega all'operatore. Quando un repressore è legato all'operatore ostacola la funzione del RNA-polimerasi, che non può dare inizio ai suoi spostamenti lungo la molecola; cioè non si può verificare la trascrizione del RNA-messaggero. Invece, se viene rimosso il repressore, la trascrizione può iniziare. Nell'operone-LAC, quando nel terreno di coltivazione è presente il lattosio, questo funzione da INDUTTORE legandosi al REPRESSORE e rendendolo inattivo, staccandolo così dall'OPERATORE; a questo punto l'RNA-polimerasi inizia a spostarsi lungo la molecola del DNA trascrivendo sull'RNA-messaggero i geni strutturali dell'operone.

SCHEMA RIASSUNTIVO

A)    In assenza di lattosio, il repressore si lega sull'operatore del DNA impedendo la trascrizione.

B) In presenza di lattosio, il REPRESSORE è inattivo, quindi l'RNA-polimerasi sintetizza l'RNA-messaggero. I geni dell'operone vengono trascritti in un'unica molecola di RNA-messaggero, che dirige la sintesi delle proteine: l'enzima ß-galattosidasi, la proteina di trasporto, che porta il lattosio dall'esterno all'interno della cellula e l'enzima che innesca la reazione di scissione del lattosio.

CONCLUSIONE

Attualmente nell'E.coli sono stati identificati 75 differenti operoni che comprendono 260 geni strutturali. La manipolazione degli operoni da parte dell'uomo è un importante passo in avanti nel processo che induce le cellule batteriche a produrre proteine di importanza medica come l'insulina umana. Regolazione dell'espressione genica negli Eucarioti

IL CROMOSOMA EUCARIOTE

Vi sono parecchie differenze importanti tra il cromosoma batterico (procariotico) e quello degli Eucarioti. Queste differenze comprendono:

Una maggiore quantità di DNA nei cromosomi eucarioti.

Un gran numero di segmenti ripetuti con la stessa sequenza in questo DNA, buona parte dei quali privi di qualsiasi apparente funzione.

Una stretta associazione del DNA con le proteine istoniche, che hanno un ruolo importante nella struttura cromosomica.

Una maggiore complessità nell'organizzazione delle sequenze di DNA che codificano per le proteine (INTRONI ed ESONI) e nella regolazione della loro espressione.

Il costituente dei cromosomi eucariotici è la cromatina, che è costituita da DNA e proteine basiche dette ISTONI; questi sono basici e perciò sono attratti dal DNA, che è acido. Gli ISTONI sono sempre presenti nella cromatina e vengono sintetizzati in grande quantità durante la fase-S del ciclo cellulare (fase durante la quale si duplica tutto il DNA della cellula).

Gli ISTONI sono i principali responsabili del ripiegamento e dell'avvolgimento del DNA. Ci sono 5 tipi di ISTONI in tutti gli organismi; essi sono presenti in quantità enormi.

L'unità fondamentale in cui viene avvolta la cromatina è il NUCLEOSOMA (costituito da 4 coppie di ISTONI). Ogni nucleosoma è formato da una parte centrale intorno alla quale si avvolge 2 volte il filamento di DNA, come un filo attorno ad un rocchetto.

Un'altra molecola istonica si trova lungo il DNA, tra un NUCLEOSOMA e l'altro. Questa fibra di DNA avvolto ai nucleosomi dà origine in seguito a successivi ripiegamenti ordinati alla struttura cromosomica che si può osservare nelle cellule durante la mitosi e la meiosi. Altre proteine associate al cromosoma sono proteine acide che aiutano la formazione del cromosoma (Scaffold), di enzimi impegnati nella sintesi del DNA e del RNA, alcune proteine di regolazione, e numerose molecole non ancora isolate ed identificate; a differenza degli istoni, queste proteine variano da cellula a cellula.

La regolazione dell'espressione genica nei procarioti consiste in genere nella attivazione e disattivazione dei geni in risposta alle variazioni delle disponibilità nutritive dell'ambiente. Negli eucarioti, e soprattutto in quelli pluricellulari i problemi della regolazione sono molto differenti. In genere un organismo pluricellulare si forma a partire da una cellula uovo fecondata, lo zigote; questo si divide ripetutamente per mitosi, dando luogo a molte cellule, che si differenziano, dando luogo, per esempio, a cellule muscolari, nervose, ematiche, ecc.

Ogni tipo di cellula, non appena si differenzia, inizia a produrre proteine con caratteristiche differenti che la rendono distinguibile da altri tipi di cellula, sia dal punto di vista strutturale che funzionale.

Tutto ciò è evidente nei globuli rossi dei mammiferi; nei primi stati di vita fetale, i globuli rossi in via di maturazione sintetizzano un tipo di emoglobina fetale; i globuli rossi prodotti in uno stadio successivo contengono un secondo tipo di emoglobina fetale; poi qualche tempo dopo la nascita i globuli rossi cominciano a produrre l'emoglobina adulta. In questo modo i geni sono espressi in una sequenza temporale accuratamente controllata uno dopo l'altro. Inoltre, i segmenti di DNA che codificano per queste molecole di emoglobina sono espressi soltanto nei globuli rossi in via di maturazione, nonostante siano presenti in ogni cellula dell'individuo. Analogamente, la sequenza di DNA che codifica per l'ormone insulina è presente non solo nelle specifiche cellule del pancreas che producono l'insulina, ma anche in tutte le altre cellule dell'organismo. Poiché ogni tipo di cellula produce soltanto le sue proteine caratteristiche, e non le proteine caratteristiche di altri tipi di cellule, appare chiaro che il differenziamento delle cellule di un organismo pluricellulare dipende dall'inattivazione di certi gruppi di geni e dall'attivazione di altri.

Condensazione dei cromosomi ed espressione genica

Molte prove hanno dimostrato che il grado di condensazione del DNA del cromosoma ha un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica delle cellule eucariotiche. Le tecniche di colorazione rivelano 2 tipi di cromatina: l'eucromatina, che risulta meno condensata e si colora più cromatina e l'eterocromatina, che è più condensata e si colora più intensamente. Durante l'interfase, l'etero cromatina rimane condensata, mentre l'eucromatina si despiralizza; infatti la trascrizione del DNA in RNA avviene solo durante l'interfase, perché in questa fase l'eucromatina è meno condensata ed è perciò accessibile alle molecole del RNA-polimerasi. Alcune regioni di eterocromatina sono uguali in tutte le cellule e non vengono mai espresse; per esempio, l'eterocromatina che si trova vicino al centromero di ogni cromosoma. Si pensa che questa regione, che non codifica per alcuna proteina, abbia un ruolo strutturale nel movimento dei cromosomi durante la mitosi e la meiosi. In modo analogo, avvengono poche trascrizioni (o non ne avvengono affatto) dai corpi di Barr, che sono cromosomi strettamente spiralizzati ed irreversibilmente disattivati.

La disattivazione del cromosoma X avviene in maniera casuale, perciò le cellule somatiche di una femmina di mammifero non sono identiche, ma sono di 2 tipi, a seconda di quale sia il cromosoma X attivo (paterno o materno) e quale sia quello disattivato. Al contrario, il grado di condensazione di altre regioni della cromatina varia da un tipo di cellula all'altro dello stesso organismo, dimostrando così che tipi diversi di cellule sintetizzano proteine differenti, e perciò richiedono la trascrizione di segmenti differenti di DNA. Inoltre, durante il differenziamento, la quantità di eterocromatina aumenta man mano che la cellula si specializza. I segmenti di DNA non necessari alla cellula sono eterocromatici e quindi silenti.

REGOLAZIONE MEDIANTE SPECIFICHE PROTEINE DI LEGAME

Negli eucarioti, come nei procarioti, la trascrizione è regolata da proteine che si legano a siti specifici della molecola di DNA. Finora sono state identificate molte di queste proteine e dei loro siti di legame, ed è sempre più chiaro che i meccanismi sono molto più complessi rispetto a quelli dei procarioti (operone). I siti in cui si legano queste proteine di regolazione possono essere lontani centinaia, o migliaia di coppie di basi azotate dalla sequenza promotore presso cui si lega l'RNA-polimerasi e che inizia la trascrizione. Recenti ricerche indicano che variazioni di attività di alcuni di questi regolatori sono associate allo sviluppo del cancro.

ORGANIZZAZIONE DEL DNA DEL CROMOSOMA EUCARIOTE

In tutte le cellule eucariotiche sembra esserci DNA in notevole eccesso, le cui funzioni non sono del tutto note; nelle cellule umane viene espresso circa l'1% del DNA posseduto dalla cellula stessa; invece nei procarioti, tranne che le sequenze segnale e quelle di regolazione, praticamente tutto il DNA viene espresso.

CLASSI DI DNA EUCARIOTE

Il DNA delle cellule eucariote può essere classificato in 3 classi generali:

DNA altamente ripetitivo

DNA mediamente ripetitivo

DNA a copia unica

DNA altamente ripetitivo

Il DNA della prima classe è formato da brevi sequenze di 5 - 10 coppie di basi disposte in tandem (testa coda); queste sono ripetute un gran numero di volte, ed hanno di solito una prevalenza di basi A - T. Per esempio, nella Drosophila (moscerino della frutta), la sequenza    A - C - A - A - A - C - T viene ripetuta 12 milioni di volte; il 20 - 30% del DNA è costituito da queste sequenze altamente ripetitive. Si pensa che il DNA altamente ripetitivo sia di fondamentale importanza per la struttura del cromosoma. Lunghi tratti di brevi sequenze ripetitive sono stati trovati intorno al centromero e nelle estremità di tutti i cromosomi umani, dove in particolare si trovano un numero compreso tra 1.500 e 6.000 nucleotidi, nei quali una sequenza semplice (T - T - A - G - G - G), è ripetuta moltissime volte. Questa stessa sequenza semplice ripetitiva è stata trovata anche nelle estremità cromosomiche di molti altri mammiferi. Si pensa che questi "cappucci" di sequenze ripetitive conferiscano stabilità al cromosoma.

DNA mediamente ripetitivo

La seconda classe di DNA è costituita da sequenze ripetitive interposte (poste cioè tra geni a copia unica e sparse un po' in tutti i cromosomi), lunghe, in genere, 150 - 300 nucleotidi. Circa il 20 - 40% del DNA di un organismo pluricellulare è formato da queste sequenze. A differenze delle precedenti, queste sequenze codificano per alcuni specifici prodotti. Tra gli esempi di questa classe di DNA vi sono geni che codificano per istoni e per gli RNA ribosomiali presenti negli eucarioti. I geni per gli istoni sono presenti in copie multiple nelle cellule di tutti gli eucarioti pluricellulari; inoltre, le cellule di questi organismi hanno anche un numero molto grande di geni per l'RNA-ribosomiale. Infatti, queste cellule contengono circa 10 milioni di ribosomi ciascuna. Questi geni si dispongono in tandem e le regioni cromosomiche in cui si trovano formano una struttura riconoscibile al microscopio ottico, che è il nucleolo. Un altro esempio di geni codificati da queste sequenze altamente ripetitive sono quelli responsabili della formazione delle emoglobine fetali ed adulte.

DNA a copia unica

La terza classe di DNA eucariote è formata dal DNA a copia unica, in cui ogni sequenza è presente una volta sola o in 2 - 3 copie. Tutti i geni che codificano per le proteine, escluse le proteine precedentemente citate, appartengono a questa classe di DNA. Anche se questa classe di DNA costituisce il 50 - 70% del DNA totale, sembra che solo l'1% del DNA totale venga poi tradotto in proteine. Una parte di questo DNA a copia unica che non codifica, può essere associato alla presenza di lunghi trattidi DNA spaziatore, il quale non viene mai trascritto in RNA.

INTRONI ED ESONI

Tutte le sequenze dei geni codificanti per le proteine eucariotiche, non sono continue, ma interrotte da sequenze non codificanti che non vengono tradotte in proteine. Queste interruzioni non vengono tradotte, mentre le sequenze codificanti sono chiamate ESONI. Questa alternanza di tratti codificanti e non codificanti si trova all'interno di un singolo gene. La scoperta degli INTRONI si è avuta in seguito ad esperimenti di ibridazione tra m-RNA e DNA; si vide che gli m-RNA che si trovavano nel citoplasma erano molto più corti delle sequenze geniche corrispondenti sul DNA, proprio a causa della presenza in questi ultimi degli INTRONI. Gli INTRONI vengono inizialmente trascritti nelle molecole di RNA primario (hn-RNA) e poi eliminati prima del trasferimento dell'RNA messaggero maturo dal nucleo al citoplasma. Questo processo di maturazione dell'RNA messaggero avviene all'interno del nucleo. Il numero di introni per gene può variare ampliamente. Gli introni sono stati trovati anche nei geni che codificano per gli RNA-ribosomialie per gli RNA di trasporto che non verranno mai tradotti.

FUNZIONI DEGLI INTRONI

Sebbene le funzioni degli introni non siano ancora note, un'ipotesi è che essi favoriscano la ricombinazione[1]: infatti, durante la meiosi, è molto più probabile che il crossing-over avvenga nei geni contenenti gli introni che nei geni che ne sono privi, proprio a causa delle maggiori distanze nei geni che hanno gli introni.

TRASCRIZIONE ED ELABORAZIONE DELL'M-RNA NEGLI EUCARIOTI

A grandi linee, la trascrizione negli eucarioti è uguale a quella dei procarioti. Essa inizia con l'attacco di una RNA-polimerasi ad una particolare sequenza nucleotidica, il promotore, sulla molecola di DNA. L'enzima si sposta quindi lungo la molecola di DNA sul filamento che si trova nella direzione 3¹à5¹. Le molecole di RNA che costituiscono il prodotto finale della trascrizione (m-RNA, t-RNA, r-RNA) svolgono quindi le loro specifiche funzioni nella traduzione delle proteine. Nonostante questa somiglianza di base, vi sono alcune importanti differenze fra la trascrizione, la traduzione ed i fenomeni ad esse connessi degli eucarioti e quelli dei procarioti. La prima importante differenza è che i geni eucarioti non sono raggruppati in operoni, nei quali uno o più geni strutturali vengono trascritti in un'unica molecola di RNA. Negli eucarioti, invece, ogni gene strutturale viene trascritto separatamente e la sua trascrizione ha dei sistemi di controllo specifici. Una seconda importante differenza è che negli eucarioti, al contrario che nei procarioti, trascrizione e traduzione sono separate nel tempo e nello spazio. Dopo che nel nucleo la trascrizione è terminata, i trascritti mi m-RNA primari vengono ampliamente modificati prima di essere trasportati nel citoplasma, dove avviene la traduzione. Le modifiche iniziano anche prima che la trascrizione sia completata; infatti, mentre il filamento di m-RNA in via di formazione è lungo solo una ventina di basi, un "cappuccio" di un insolito nucleotide si codifica sulla sua estremità 5¹ (questa estremità si chiama leader) ora sappiamo che questo "cappuccio" (guanosina modificata) è necessario per legare l'm-RNA al ribosoma eucariote. Completata la trascrizione e liberata la molecola di RNA dal DNA stampo, si ha la seconda importante modifica, e cioè, speciali enzimi raggiungono una sequenza di nucleotidi adenina (poli-A) all'estremità 3¹ della molecola (trailer) questo nuovo segmento di poli-A può contenere fino a 200 nucleotidi. Prima che le molecole di m-RNA modificato lascino il nucleo, si ha la terza importante modifica; gli introni vengono eliminati e gli esoni sono saldati insieme in sequenza per formare un'unica molecola continua. Il meccanismo di saldatura (si chiama splicing) è molto preciso, dal momento che un piccolo errore causerebbe uno spostamento del sistema di lettura del messaggio trascritto. Si conoscono oggi numerosi esempi nei quali i trascritti di m-RNA identici vengono rielaborati in maniere diverse. Tali differenti splicing possono dare origine alla formazione di più di un polipeptide funzionale a partire da molecoledi RNA che erano originariamente identiche; in questi casi, un introne può essere lasciato e diventare un esone o viceversa. Quindi, come si può notare, più si studia il DNA eucariote e la sua espressione, e più è difficile dare una definizione precisa di gene, introne ed esone. Per molti anni, è sembrato corretto ritenere che, a parte le ricombinazione dovute al crossing-over, il cromosoma eucariotico fosse stabile ed immutabile; però è stato dimostrato che sia negli eucarioti che nei procarioti, i segmenti di DNA possono spostarsi da un punto all'altro del singolo cromosoma, possono entrare ed uscire dal cromosoma, possono spostarsi da un cromosoma all'altro e talvolta persino da un organismo all'altro (elementi genetici trasponibili, o trasposoni).