RICERCA DELLE SALMONELLE - Prearricchimento, Arricchimento selettivo, Isolamento, Identificazione biochimica

RICERCA DELLE SALMONELLE

Le Salmonelle sono enterobatteri gram negativi,aerobi, non fermentanti il lattosio, asporigeni,mobili,provvisti di ciglia. Gli appartenenti a questo genere sono tra i più frequenti patogeni intestinali dell'uomo, capaci di provocare infezioni gastroenteriche tipiche, come il tifo e i paratifi, o anche forme tossinfettive, che attualmente sono le più diffuse. Si è assistito, negli ultimi anni, ad un progressivo aumento dei casi di salmOnellosi nelle varie specie animali, che sem­bra dovuto all'uso di mangimi e di sfarinati preparati in con dizioni igieniche non adeguate. L'aumento delle salmonellosi animali ha incrementato enormemente la diffusione di questi germi (anche di forme esotiche) e questo, ha avuto come conseguenza l'aumento dei casi dl salmonellosi umana. Gli alimenti costituiscono, il veicolo più comune per le infezioni da Salmonella, o perché derivano da animali infetti (infezione en­dogena) o perché esposti alla contaminazione durante la loro manipolazione (infezione esogena). Per le sindromi tifoidi è sufficiente che nell'organismo siano ospitate alcune cellule, mentre, per i sierotipi responsabili di gastroenteriti non gravi, è necessaria la presenza di un gran numero di cellule

(10 6-l0 9). Questo fatto rende estremamente importante la co­noscenza dei fattori chimico-fisici che influiscono sulla moltiplicazione delle Salmonelle, in modo che si possa interventi re sull'alimento per creare delle condizioni che ostacolino

il loro sviluppo e per operare dei trattamenti che ne escluda no la presenza. La ricerca delle Salmonelle è un momento fondamentale nel controllo microbiologico non solo degli alimen­ti destinati al consumo, ma anche delle materie prime e degli impianti di produzione. Infatti, se le Salmonelle nell'alimento rappresentano un pericolo immediato per l'uomo che è esposto ai rischi dei fenomeni patologici ad esse legati, la pre­senza di questi microrganismi nelle materie prime e nei vari stadi della produzione costituisce un fatto di notevole inte­resse epidemiologico, in quanto è per questa via che si attua la contaminazione e che aumenta il numero dei portatori sani.

Tecnica:

La ricerca delle Salmonelle va effettuata seguendo una proce­dura abbastanza complessa che comprende:

prearricchimento

arricchimento selettivo;

isolamento;

identificazione.

Prearricchimento

Viene effettuato ponendo in termostato a 37 C per 24 h la diluizione iniziale 10^-l. Il Nutrient Broth da noi adoperato come diluente è un terreno comune,privo di sostanze inibenti, che permetterà alle Salmonelle eventualmente presenti di aumentare la loro vitalità. (Tab 14)

Arricchimento selettivo

La presenza delle Salmonelle in un alimento generalmente si accomna a quella di molti altri Enterobatteri, che essendo capaci di sopportare più agevolmente condizioni sfavorevoli, costituiscono la parte preponderante della flora microbica, rendendo impossibile l'evidenziazione delle Salmonelle presenti. Si ricorre quindi all'arricchimento selettivo, cioè all'inseminamento in terreni contenenti fattori di crescita per Salmonelle e sostanze capaci di inibire, o per lo meno, di ritardare lo sviluppo della microflora concomitante.

Abbiamo adoperato, come terreni di arricchimento, il Selenite-Cystine Broth (Difco) e Il Tetrathionate Broth Base (Difco) con l'aggiunta di una soluzione iodo-iodurata.

Il primo terreno ha come fattore selettivo il sodio selenito, che è in grado di rallentare la crescita della maggior parte degli Enterobatteri ad esclusione di Salmonelle e Proteus che non risentono di questa azione inibitoria. Il sodio selenito è un composto termolabile, per cui il terreno va disciolto in acqua calda ma non bollente, poco prima dell'uso, e non va sterilizzato in autoclave.

Il secondo dei terreni usati per l'arricchimento selettivo è il Tetrathionate Broth al quale si aggiunge, poco prima della semina, una soluzione iodo-iodurata (1 ml di soluz. + 50 ml di terreno). Lo iodio aggiunto permette l'ossidazione dei tiosolfato di sodio e la formazione di tetrationato di sodio che è tossico per la maggior parte degli Enterobatteri (anche per alcu­ne specie di Salmonella) ,mentre invece viene sopportata da molte Salmonelle e dai Proteus che hanno sistemi enzimatici in grado di metabolizzarlo. Anche il tetrationato di sodio è termolabile e quindi dopo l'aggiunta dello iodio al terreno non si può effettuare nessun riscaldamento.

Si allestiscono le prove nei seguente modo:

dalla brodocultura di prearricchimento 5 ml vengono prelevati e seminati in 50 ml di Selenite-Cystine Broth che viene poi incubato a 44° C per 48 h. (Tab.14)

la stessa quantità viene posta in 50ml di Tetrathionate Broth Base al quale è stato aggiunto 1ml della soluz. iodo-iodurata. L'incubazione per questa prova va fatta a 37°C per 24h.(Tab.l4)

Isolamento

Per l'isolamento si usano terreni selettivi che contengano, oltre alle sostanze inibenti la microflora concomitante, degli indicatori che rendano più facilmente riconoscibili le colonie di Salmonelle.

I terreni da noi adoperati sono: SS Agar (Difco) e Brilliant Green Agar (Difco).

Il  primo consente una buona differenziazione delle specie che fermentano il lattosio dalle specie non fermentanti,inoltre ha un elevato potere inibitorio sui gram positivi. Su questo ter­reno lo sviluppo dei Coliformi viene ritardato e viene impedi­ta la sciamatura dei Proteus, ossia la tendenza di questi batteri ad invadere la superficie delle piastre. Le Salmonelle cre­scono con colonie incolori, trasparenti, liscie, traslucide. Gli stipiti che producono idrogeno solforato danno colonie con centro nero per la precipitazione dei solfuro di ferro,e se il numero delle colonie e'abbondante si può osservare un viraggio al giallo del terreno.

Per allestire la prova di isolamento, il terreno viene preparato poco prima dell'uso e versato in piastra, senza sterilizza­zione in autoclave.

Su due piastre distinte vengono effettuate due semine, una dal terreno al tetrationato ed una dal terreno al selenito, ovvia­mente in tempi diversi poiché le due culture di arricchimento hanno tempi d'incubazione diversi.

La semina si esegue prelevando un'ansata dei materiale da seminare e strisciando sulla superficie della piastra in modo tale che vi sia una zona con deposizione più scarsa, dove si possano eventualmente osservare,dopo la crescita, colonie isolate (Tab.l4) L'altro terreno usato per l'isolamento e'il Brilliant Green Agar (Difco), dotato di una spiccata selettività, per le pre­senza di verde brillante in concentrazioni che risultano tossi che per altri Enterobatteri, ma ben sopportate dalle Salmonelle. Il terreno contiene, come carboidrati, il lattosio e il sacca­rosio e come indicatore il rosso fenolo, che vira al giallo in ambiente acido e al rosso scuro in ambiente alcalino.

Le Salmonelle, crescendo in questo terreno, metabolizzano i carboidrati presenti dando composti alcalini. Le colonie appariranno di color rosa pallido,circondate da un alone rosso nell'agar. Altri Enterobatteri che riescono a crescere, superando le difficoltà di un terreno tanto selettivo, utilizzano i carboidrati presenti dando cataboliti acidi e producendo quindi un viraggio al giallo dei terreno circostante.

Generalmente le colonie di questi ultimi hanno un colore gial­lo verde. Solo alcuni Proteus possono svilupparsi formando co­lonie rosse.

Sulle piastre di Brilliant Green Agar si effettua lo stesso tipo di semina che è stato effettuato su Agar SS, prelevando ne­gli stessi tempi, dalle colture di arricchimento. L'incubazione per i due terreni di isolamento va fatta per 48 h a 37 C. (Tab. 14)

Dopo il tempo di incubazione si esaminano le piastre per rile­vare le caratteristiche delle colonie che vi sono cresciute. Nell'ambito delle Enterobatteriaceae esistono diversi biotipi con caratteri biochimici simili a quelli delle Salmonelle,alme no per ciò che riguarda le attività metaboliche testate con i terreni selettivi adoperati.

Anche in presenza di colonie tipiche è necessario, quindi, pro cedere ad una più completa conferma biochimica e, se richiesto, anche a quella sierologica.

Identificazione biochimica

L'identificazione biochimica consiste nel. sottoporre la colo­nia sospetta, prelevata dalla coltura di isolamento, a varie prove, mediante le quali si saggiano le attività metaboliche del microrganismo, come la capacità di fermentare determinati zuccheri, di produrre indolo, di produrre H₂S, di utilizzare il citrato, ecc.

Da queste prove si ricava un numero di informazioni sufficien­te ad identificare il batteria isolato.

Sono in commercio dei sistemi miniaturizzati che consentono di effettuare contemporaneamente molte prove partendo da un'unica colonia prelevata dal terreno di isolamento.

Per alcuni dei sistemi sopra indicati,i risultati delle reazioni sono stati convertiti in profili numerici, di un certo numero di cifre che danno la possibilità di una rapida identificazione, attraverso la consultazione di codici forniti dalla ditta stessa.

RISULTATI

Come sempre, a ciascuno dei cinque gruppi è stato affidato un campione da esaminare. La carne tritata era stata acquistata presso tre diverse macellerie. Abbiamo dato il N.l al campione proveniente dalla prima macelleria, il N.2 a quello della seconda, e abbiamo frazionata quello proveniente dalla terza in tre porzioni che abbiamo indicato come campioni N.3, 4, 5.

La tabella seguente riunisce i risultati ottenuti:

Per poter esprimere una valutazione igienica delle carni esaminate, abbiamo fatto il raffronto dei dati con uno standard microbiologico di riferimento proposto da alcuni autori (Simoni, Bal. Dacini e Bianucci).