Biochimica Strutturale

Biochimica Strutturale

Melandri 0512091293

Mu~ = Mustandard + RTln [C] + zFV

--> e per giunta C dovrebbe essere sostituita dall'attività, che è solitamente inferiore alla C a causa delle interazioni.

Questo genera un gradiente elettrochimico dipendente dalla C (o meglio dall'attività), e dalla carica della molecola; espresso come differenza tra l'interno e l'esterno:

deltaMu~ = deltaG = RTln [C]e / [C]i + zF (Ee - Ei)

Ovviamente il Mustandard è uguale da entrambe la parti della membrana solo perché sono entrambe soluzioni acquose (=stesso solvente); misurando ad es. tra l'esterno e in mezzo ai lipidi di membrana (=diverso solvente), la differenza dei Mustandard dovrebbe essere considerata. In realtà, anche considerare i solventi intra- ed extra- cellulari come soluzioni perfettamente acquose è discutibile

Si mette il potenziale (e la concentrazione) della fase finale al segno positivo e quello della fase iniziale al segno negativo (cioè x2 - x1).

Il potenziale standard è il potenziale quando C (o attività) è 1, e quindi il suo logaritmo è 0.

Un potenziale è la derivata parziale dell'energia libera di Gibbs rispetto alla molarità di quella sostanza.

Lo spessore della parte idrofobica della membrana è attorno ai 40 Å, e mentre la costante dielettrica dell'acqua è circa 80, nei lipidi è 2. Inoltre, lo ione si trova ad essere estremamente sfavorito in un ambiente dove non può crearsi una sfera di solvatazione né creare alcuna interazione polare; pertanto la sua 'estrazione' nella fase lipidica di membrana è talmente sfavorevole da essere lentissima.

Una molecola non ionica, come il glucosio, espone però degli OH che generano ponti H con l'acqua circostante, e anche in questo caso la sua 'estrazione' nei lipidi di membrana significa la rottura senza possibilità di sostituzione dei ponti H.

In entrambi i casi, il coefficiente di diffusione è bassissimo, e quindi minimo è il flusso attraverso la membrana. Da qui la necessità dei canali, che formano legami col soluto per compensare la perdita dei legami con l'acqua (legami ad energia paragonabile, ma non superiore, o il soluto resterebbe intrappolato nel canale). Analogamente a un enzima, abbassa il deltaG dell'attraversamento della membrana.

Ogni canale è stereospecifico, in quanto la sua geometria si adatta nella maniera migliore alla struttura di uno specifico soluto.

Porine

Proteine di trasporto non selettive, localizzata sulla membrana esterna dei batteri Gram-

Struttura circolare a barile beta antiparallelo up-and-down, formata da 16 filamenti, a formare un manicotto alto circa 40 Å. Un'ansa e una piccola elica sporgono all'interno del foro.

Lungo la parete c'è un'alternanza di aa idrofilici e idrofobici: questi ultimi si affacciano verso l'esterno, mentre i polari sporgono verso l'interno (ciò è dovuto alla natura del foglietto beta, in cui i residui laterali sporgono sempre in trans). I residui polari sono sensibili alla solvatazione, e dato che la dimensione del canale lo consente, il canale è sempre pieno di acqua.

Un barile beta ha sempre almeno 8 filamenti; ma un barile di soli 8 filamenti ha il foro centrale occluso dai residui laterali. Per avere un canale accessibile bisogna aumentare il numero dei filamenti.

Attenzione a fare calcoli sui file PDB, perchè anche nella spacefill non sono cmq rappresentati gli H, a meno che la risoluzione non sia migliore di 1.40, molto rara (solitamente è tra 2.2 e 3.5).

L'acqua che troviamo nei file PDB non è acqua del solvente, casualmente presente, ma è acqua di cristalizzazione, sempre presente sui milioni di molecole analizzate, e quindi stabilmente o comunque costantemente legata alla struttura della proteina.

Altre porine sono selettive, es: per il saccarosio. Formata da un barile beta di 18 filamenti, con un foro centrale teoricamente maggiore della porina più piccola, ma in realtà molto meno accessibile a causa di alcune anse sporgenti.

Un'ansa ad uncino su ciascun canale permette l'attacco al canale adiacente e la formazione dell'omotrimero. Interazioni idrofobiche stabilizzano poi il complesso.

Il poro presenta solo una breve regione di selettività per il saccarosio (filtro di selettività), il cui spessore è molto inferiore allo spessore totale del poro (e della membrana), per evitare troppe interazioni forti che sfavorirebbero un passaggio rapido del soluto. Questa regione è caratterizzata dalla presenza di amminoacidi aromatici (W e Y), quindi strutture idrofobiche e ari. La stereochimica del saccarosio infatti presenta tutti gli OH su una faccia, mentre espone quasi solo CH sull'altra. Gli aa aromatici possono quindi interagire con le loro strutture ari idrofobiche con la faccia idrofobica del saccarosio, orientandolo nella direzione correttta perché gli OH sull'altra faccia del disaccaride possano creare ponti H con gli aa polari (R e D) sull'altro lato del canale.

La distanza massima a cui è possibile ammettere un ponte H tra due atomi adatti è di 3.2 Å

Aquaporine

10 famiglie negli eucarioti (Apq 0-9), divise in due classi: specifiche per l'acqua, oppure capaci di trasportare anche alcune altre piccole molecole ossidrilate.

Facilitatore del trasporto del glicerolo di E.Coli: piccolo canale cilindrico di alfa eliche, organizzate in due metà circa speculari probabilmente derivate dalla fusione genica di due monomeri; risulta una proteina pseudodimerica anche se costituita da un unico polipeptide. Il filtro di selettività è formato da due alfa eliche più corte che si incontrano invertite dentro il canale, ciascuna presentando una sequenza NPA conservata in tutte le aquaporine (in particolare, è l'N amidico dell'asparagina il responsabile del legame con l'acqua).

La larghezza del canale permette il passaggio, oltre che dell'acqua, anche del glicerolo; la mancanza di specificità aumenta la permeabilità dell'acqua a causa della maggior larghezza del canale e del minor numero di legami con le pareti.

Come il saccarosio, il glicerolo può mostrare qualità anfipatiche, con tutti gli ossidrili su una faccia e i residui CH sull'altra; e l'aquaporina mostrerà residui polari su un lato del canale e residui apolari sull'altro, in modo da orientare il glicerolo. L'acqua si dispone intervallata ai gliceroli a fare da ponte (ma può essere trasportata anche in assenza di glicerolo: basta sostituire agli ossidrili del glicerolo altrettante molecole d'acqua e il modello funziona benissimo).

Con esperimenti di light scattering su liposomi in soluzione ipertonica di glicerolo, si è osservato che in presenza di aquaporina sulla superficie dei liposomi dà origine a un efflusso di acqua decrescente, in quanto l'acqua stessa rientra attraverso il trasportatore, e così il glicerolo, riducendo anche la differenza di osmolarità. Cambiando la natura del soluto con ribitolo, xylitolo eccetera, si nota che le strutture più simili al glicerolo vengono trasportate meglio, mentre quelle troppo lunghe o cicliche non vengono trasportate affatto.

I liposomi sono strutture spontanee con un sacco di difetti di permeabilità, non del tutto indicativi di una vera membrana.

Un'alfa elica transmembrana deve essere lunga tra i 25 e i 30 aa (40 Å di spessore della membrana diviso 5.6 Å per giro d'elica, per 3.6 aa per giro).

Tutte le porine (incluse le aquaporine) non sono selettive per la direzione, che è decisa soltanto dal segno del gradiente elettrochimico del soluto.

Aquaporina I eucariotica: molto simile alla procariotica, ma specifica per l'acqua. La differenza sta nel diametro del poro, grazie ad aa ingombranti come l'istidina che si affaccia nel lume del poro.

Tutte le aquaporine fanno passare l'acqua ma non gli ioni (nemmeno gli H+). I cationi sono esclusi dal poro in quanto i carbonili che sporgono nel canale sono troppo pochi per permettere una completa coordinazione dello ione sostitutiva della solvatazione. Inoltre i tratti di legame per l'acqua sono intervallati da zone completamente idrofobiche, per cui l'acqua 'salta' da un sito all'altro. Ciò determina l'esclusione dei protoni, a causa dell'impossibilità di formare una catena organizzata di molecole d'acqua all'interno del poro (troppo distanti tra loro a causa dei 'salti'), necessaria al meccanismo di Grotthus (rapido trasferimento di un H+ partendo da uno ione idronio attraverso una sequenza di molecole d'acqua = 'proton wire').

Canali del potassio

Canale KCSA: omotetramero di alfa eliche; ogni monomero ha tre eliche transmembrana e una piccola ansa che si espone all'interno del polo, contenente i cinque aa responsabili del filtro di selettività.

A canale aperto, il K+ entra sul lato intracellulare solvatato, grazie all'ampiezza della cavità intramembrana generata dalle eliche (molto più larga del tipico poro), poi perde la solvatazione a livello dei 20 aa del filtro di selettività (solo 12 Å, meno di un terzo dello spessore = conduttanza molto alta), infine esce sul lato extracellulare attraverso un cono di uscita.

Nel filtro (sequenza TVGYG ripetuta quattro volte; conservata in tutti i canali noti) il K+ è legato ai CO della main chain con un coordinamento perfetto per il suo diametro ionico: otto CO (due corone da quattro) coordinano due ioni potassio; lo ione più in alto presenta due posizioni di legame alternative e leggermente sfalsate, per cui nel cristallo (che è la media di milioni di molecole) appaiono due ioni parzialmente sovrapposti, cosa che in realtà è fisicamente impossibile perché i due atomi violerebbero i reciproci raggi di Van Der Waals.

Attorno al filtro è presente una struttura responsabile del mantenimento della rigidità del filtro, per evitarne la deformazione: la T della sequenza conservata del filtro lega un W dell'elica esterna del poro, entrambi aa aromatici ari rigidi; inoltre i W esterni si inseriscono tra i lipidi di membrana (sono idrofobici) e formano anche un legame H con le teste polari degli stessi, creando una sorta di ciambella di ancoraggio. Ricordiamo infatti che il filtro di selettività si trova su un'ansa, che di per sé è un struttura flessibilissima.

In tutti i canali del K+ c'è un piccolo aa (come la glicina) che permette la piegatura delle eliche verso il basso per aprire il canale; normalmente un'elica è trattenuta da ponti H e dall'ingombro sterico delle proprie catene laterali: in presenza di una forza sufficiente a rompere i ponti H, pertanto, una glicina (che è priva di ingombro laterale) costituisce un punto di debolezza dove la piegatura è possibile.

Canali del potassio calcio-attivati di Methanobacterium Thermoautotroficus: il canale interagisce con un dominio citoplasmatico RCK (regolatore della conducibilità del K+), generato per taglio proteolitico o per una sorta di splicing alternativo dal medesimo trascritto che genera il canale. La struttura completa dell'RCK è un omottamero, quattro subunità continue col canale e quattro no.

Ogni subunità interagisce con la subunità immediatamente sotto tramite quattro alfa eliche, due contro due, con una giunzione rigida.

La giunzione tra una subunità e quella adiacente in orizzontale, invece, avviene con una giunzione mobile la cui flessibilità è governata allostericamente dal legame col calcio (uno ione Ca++ per subunità).

Il cambiamento conformazionale indotto dal calcio si trasmette al canale con una tensione divaricante che apre le alfa eliche al di sotto della camera di idratazione, e quindi al di sotto anche del filtro di selettività.

Però la concentrazione di Ca++ usata nel cristallo è 200 mM, mentre le [C] di calcio fisiologiche sono nell'ordine del nM, quindi anche se il cristallo dimostra la struttura aperta in risposta al calcio, il significato fisiologico di questo è un altro paio di maniche

In alternativa ai liposomi si possono usare membrane ari, cioè strati di fosfolipidi posti a fare da setto tra due celle in ciascuna delle quali possiamo mettere un elettrodo di misura. Facendo fondere liposomi contenenti la proteina canale con la membrana possiamo studiarne l'elettrofisiologia; una sorta di patch-clamp in grande, col limite che bisogna controllare molto bene la direzione con cui il canale si inserisce nella membrana (le tossine inibiscono solo se si legano sul lato esterno, tra l'altro).

Canale del cloro: molto conservato dai batteri agli eucarioti; omodimero di alfa eliche, ciascun monomero è generato per ripetizione e inversione della medesima proteina e funziona indipendentemente dall'altro membro del dimero. E' un canale passivo, specifico per anioni, che però oltre al cloro probabilmente lascia passare anche il bromo.

Le due metà del monomero sono antispeculari rispetto all'asse del poro, ed espongono nel canale quattro eliche più corte che convergono a formare il filtro di selettività (sito di coordinazione del Cl-) coi residui delle loro anse.

La proteina presenta le proprie alfa eliche corte con l'estremità N-term (e quindi positiva) verso l'interno del canale, le une contro le altre; questo genera un eccesso di carica positiva all'interno del canale che favorisce l'ingresso degli anioni e sfavorisce quello dei cationi. Lo stesso discorso, a polarità invertita, vale per il canale del potassio.

Il diagramma topologico di una proteina è la struttura della stessa sviluppata su un piano: alfa eliche  indicate con lettere maiuscole e foglietti beta con numeri o lettere minuscole, nell'ordine dato dalla struttura primaria; nel diagramma però le strutture vengono collocate schematicamente secondo la posizione occupata nella proteina ripiegata.

Canale del potassio voltaggio-dipendenti: cristallizzato da batteri termofili di profondità (Aeropyrum Thermix), omologo al gene shaker di Drosophila, probabilmente applicabile a tutti gli eucarioti. Non si riusciva a cristalizzare perchè troppo flessibile, ed è stato irrigidito con frammenti Fab mirati contro un epitopo specifico, e capaci di legarsi solo in determinate condizioni adatte all'esperimento (es: di pH).

Il file studiato è un .mmol derivato per rotazione dal .pdb in modo da ricostruire il tetramero (è molto grosso e presenta alcuni errori).

E' analogo al canale del potassio già studiato: sei eliche transmembrana, più piccola elica ed ansa P tra S5-S6, che in tetramero formano il canale e il filtro di selettività (sequenza e struttura conservate); la regione sensore del voltaggio è attorno a una forcina tra S3-S4, che giacciono parallele al piano della membrana, ed è costituita di arginine. E' possibile immobilizzare il canale aperto con un Fab specifico per S3-S4, ma solo legandolo sulla faccia esterna (ergo la parte mobile della proteina sporge all'esterno). Alternativamente è possibile bloccare la forcina biotinilata con avidina (dopo aver mutagenizzato la proteina per inserire cisteine -bersaglio della biotinilizzazione- in varie posizioni, e sostituire l'unica cisteina di background con una serina). Alcune posizioni sono accessibili all'avidina solo dall'esterno, altre solo dall'interno e altre da tutte e due le parti. Grazie allla lunghezza del braccio spaziatore della biotina, sappiamo che le cisteine che si trovino entro 10 Å da una delle due facce della membrana sono accessibili all'avidina da quel lato. Si è potuto in questo modo stabilire la notevole mobilità della forcina verso l'alto e verso il basso (infatti possiede regioni riconosciute sia dall'interno sia dall'esterno) seguendo il potenziale: essendo ricca di arginine, infatti, la regione sarà respinta dal lato della membrana con maggiore carica positiva e migrerà verso la maggiore carica negativa. Questo movimento dell'N-term si trascina le eliche S5-S6 al seguito, aprendo e chiudendo il canale.

Nel cristallo il canale appare aperto sebbene le eliche S3-S4 siano nella posizione più in basso, probabilmente perché gli anticorpi usati per immobilizzarlo ne distorcono la struttura.

Per ovviare all'uso degli anticorpi si potrebbe generare un canale mutante per le glicine cerniera, che quindi rimanga sempre immobilizzato.

Anche da studi fisiologici su questo canale si è rilevato che a potenziali depolarizzati (e quindi con la forcina verso l'esterno) il canale risulta chiuso, mentre dovrebbe essere aperto; però siccome gli impulsi sono 10-l2 dati in successione (visto che con meno non si vedrebbe chiaramente l'effetto) potrebbe entrare in gioco un fenomeno di autoinibizione (es: modello della 'palla incatenata').

Nel canale shaker di Drosophila sono state individuate 42 mutazioni nell'elica S1, che potrebbe interagire col canale ed essere coinvolta nell'autoinibizione, senza contattare il sensore del potenziale.

Un'altra obiezione sulla struttura è che una forcina così carica positivamente possa muoversi attraverso i lipidi; la spiegazione data è che si comporti come un catione idrofobico: la carica positiva è diluita su un ingombro idrofobico molto esteso (es: valinomicina, chelante del K+ con struttura ad anello, che genera un guscio idrofobico attorno alla carica positiva e permette la migrazione attraverso le membrane - anche molto velocemente).

Correnti di gating: correnti dovute a spostamenti di cariche all'interno della struttura della proteina canale in risposta a una variazione di tensione, anche quando questa è inibita con ammine quaternarie, e quindi chiusa (ergo non abbiamo contributo degli ioni allo spostamento di cariche). Questo comporta che l'apertura del canale coinvolga lo spostamento di amminoacidi-sensore equivalenti a una decina di cariche elementari per lo spessore dell'intera membrana, o più cariche per distanze minori.

Oltre all'immobilizzazione, un'altra ragione per usare un anticorpo in studi di cristallizzazione è per rivestire la porzione extramembrana di una proteina di membrana in modo da ridurre la superficie di proteina ricoperta di detergenti (necessari all'estrazione della proteina dai lipidi, ma che riducono l'efficienza di cristalizzazione e quindi la risoluzione) e aumentare la porzione idrosolubile.

Trasporto attivo secondario (cotrasporto)

Dipende dalla dissipazione di un gradiente ionico, precedentemente generato da una pompa attraverso il consumo di energia. Es: simporto fosfato-protone (procarioti) e antiporto sodio-calcio (mammiferi)

Scambiatore fosfato-glicerofosfato di E.Coli: membro della superfamiglia MTF, parzialmente conservata attraverso gli organismi. Pseudodimero di dodici eliche transmembrana ripetute e invertite, a formare una sorta di calice. Nel cristallo è privilegiata la confomazione aperta verso il citoplasma e chiusa verso l'esterno. Quattro alfa eliche storte (grazie alla presenza di proline) affacciate due a due permettono un movimento a clessidra incentrato su due fulcri; questo movimento si trascina dietro il resto delle eliche, provocando la rotazione della coppa.

Due arginine sul fondo della coppa attraggono il fosfato col gruppo guanidinio e coordinano gli ossigeni con ponti idrogeno. La distanza tra le due R è di 9.9 Å, un po' troppo per le dimensioni del fosfato più la lunghezza di un ponte N-H-O; quando il fosfato è legato la distanza deve scendere a 8.5 Å circa. Questo avvicinamento forzato induce il cambiamento conformazionale e la rotazione della coppa, esponendo il fosfato (o glicerofosfato) sul lato opposto della membrana. La presenza di uno dei due ligandi è necessaria alla rotazione, e quindi il flusso di una specie è dipendente dal flusso dell'altra. La direzionalità è data unicamente dalla differenza tra le concentrazioni interne ed esterne delle due specie; la proteina è unicamente un catalizzatore del trasporto, privo di direzionalità intrinseca.

Trasportatore del lattosio: recuperare

Scambiatore ATP-ADP mitocondriale: struttura a coppa con eliche convergenti che chiudono un lato e lasciano aperto l'altro. Tre coppie di eliche transmembrana omologhe due a due. Il legame di ATP o ADP (entrambi sullo stesso sito, caratterizzato da tre R seguite da tre M; le prime possono formare ponti H con l'anello purinico dell'ATP, le seconde creano un impedimento sterico al passaggio) è necessario al cambiamento conformazionale. Il flusso dell'uno dipende dal flusso dell'altro, il trasporto non ha direzionalità intrinseca. La specificità è per l'ATP, e non per altri nucleotidi di- o tri-fosfati. Il canale è inibito specificatamente dall'atractiloside, un veleno vegetale, e dall'acido vonkretico, la prima dall'esterno, il secondo dall'interno. L'atractiloside imita l'anello dell'ATP.

La proteina è cristallizzata aperta verso l'esterno perché legata all'atractiloside. Non è disponibile la struttura della proteina legata all'acido vonkretico, quindi aperta verso l'interno.

Questa struttura (sei eliche in tre coppie) è comune a tutti i trasportatori di metaboliti mitocondriali (aspartato-malato, citrato-malato, ornitina-citrullina, ecc.)

Nella stessa famiglia è presente anche la termogenina, un trasportatore di protoni che dissipa il gradiente protonico generando calore (grasso bruno).

I mitocondri possono accumulare ATP sull'ADP in un rapporto fino a 500:1 (cioè consumano tutto l'ADP disponibile).

Lo scambio ATP-ADP (che genera uno squilibrio di una carica) è reso possibile dal potenziale di membrana, che a sua volta è generato dalla pompa protonica, quindi è una sorta di trasporto secondario 'nascosto'.

Dall'equazione di Nernst: ogni 60mV di differenza tra le due facce della membrana è un fattore 10 di concentrazione di differenza.

Rompendo un mitocondrio (o un battere) con ultrasuoni o altri emtodi violenti, le membrane si rovesciano spontaneamente come un guanto.

Trasporto primario

Un unico complesso enzimatico accoppia una reazione esoergonica con il trasporto di un metabolita, in contemporanea.

Trasportatori ABC: presentano tutti una sequenza Walker A (dal nome dello scopritore), più nota come P-loop (G-X-X-G-X-G-K-S/T) sito di legame universale per i nucleotidi trifosfato. La sequenza Walker B è meno caratterizzata, ma la sua funzione è di promuovere l'attività catalitica di idrolisi del trifosfato.

La terza sequenza, a differenza delle prime due che sono abbastanza universali, è il 'signature motif', specifico degli ABC.

Sono trasportatori ABC il canale del cloro responsabile della fibrosi cistica e l'MDR (multidrug resistance) cellula - STRUTTURA DELLE CELLULE EUCARIOTE" class="text">delle cellule cancerose, che conferisce resistenza ai chemoterapici in base al loro generale carattere idrofobico. Ancora, sono ABC le flippasi (le MDR potrebbero essere mutazioni o adattamenti delle flippasi), e il sistema di trasporto dell'istidina in Salmonella, o della vitamina B12 in Coli, o del maltosio, o del fosfato.

Rad50 di Pyrococcus fuoriosus: enzima di riparazione del DNA, al ME si presenta come un manubrio; due domini globulari distanziati da un'elica di 600 aa (circa 800 Å), il coiled-coil antiparallelo di questa regione permette la dimerizzazione della proteina. Ha un dominio ABC che permette la formazione del dimero tra il C-term di una subunità e l'N-term dell'altra solo se legato all'ATP (a livello delle teste catalitiche soltanto: il tratto coiled-coil resta sempre unito). La cristallizzazione è avvenuta in presenza di AMP-P-N-P, che non avendo il ponte anidrico in gamma, non può essere idrolizzato.

Il P-loop (Walker A) proveniente dell'N-term si affaccia sui fosfati dell'ATP, e lega il fosfato terminale con l'amminico della lisina e il Mg++ con l'ossidrile della serina (o treonina). Le glicine permettono il corretto grado di curvatura dell'ansa.

La Walker B (che invece si trova sul C-term  e quindi proviene dall'altra subunità) si avvicina al fosfato in gamma e col carbossile di un aspartato polarizza una molecola d'acqua nelle vicinanze rendendola disponibile per la catalisi, mentre la signature motif (anch'esso sul C-term dell'altra subunità) lega i fosfati dal lato opposto, permettendo all'ATP di fare da ponte tra le due subunità.

Il Mg++ si coordina tra i fosfati in beta e in gamma dell'ATP e l'ossidrile proveniente dal P-loop, più alcune molecole di acqua. L'idrolisi avviene perché uno dei due doppietti di una molecola d'acqua in linea con l'asse dei fosfati fa attacco nucleofilo sul P in gamma, genera un intermedio di transizione pentacoordinato; l'eccesso di ossigeni e l'incompletezza dei legami O-P-O sull'asse rende instabile l'intermedio; la stabilità viene ripristinata con la rottura del legame tra fosfato in gamma e fosfato in beta; per la reazione serve una H2O reattiva (più è deprotonata meglio è; a questo pensa la Walker B), una carica positiva (come un'arginina) che neutralizzi la carica negativa dei fosfati, e un modo di bloccare il fosfato (fornito dal Mg++).

Trasportatore della vitamina B12 in Coli: cristallizzata in presenza di vanadato (un inibitore delle ATPasi che occupa il sito di legame per il trifosfato). Tetramero composto di due subunità B e due C. Una coppia espone su ciascuna subunità un P-loop, una Walker B e una signature sequence. Analogamente a quanto già visto, la P-loop e la Walker B di una subunità creano un sito catalitico che si affaccia direttamente di fronte alla signature sequence dell'altra subunità. Le altre due subunità creano il canale, due eliche da una e due dall'altra; il canale è sempre aperto verso il periplasma con dimensioni sufficienti a permettere il passaggio della B12, ma quattro treonine legate tra loro impediscono l'accesso al lato citoplasmatico; ma quando le due ABC sono entrambe legate all'ATP, il lieve avvicinamento tra le due facce di ciascun sito catalitico trasmette un cambiamento conformazionale al canale attraverso una corta elica cardine idrofobica (capace di introdursi all'interfaccia tra le subunità), che si traduce nella divaricazione delle eliche e nell'apertura delle treonine; l'idrolisi dell'ATP porta indietro la struttura per poter ricominciare. L'entrata della B12 condiziona la possibilità di legare l'ATP, escludendo cicli a vuoto; il meccanismo è ancora sconosciuto.

L'affinità del canale per la B12 -solitamente presente a concentrazioni molto basse nel mezzo extracellulare- dovrebbe essere molto alta, ma questo è incompatibile con la necessità di evitare legami troppo forti all'interno del trasportatore; pertanto il meccanismo di trasporto è completato da un meccansimo di "consegna" del ligando proprio all'ingresso del canale, mediato da BDUF. Questa proteina presenta una tasca idrofobica costituita di aa aromatici (fenilalanina e triptofano) che prende contatto con le ampie superfici idrofobiche (anelli pirrolici) della vitamina B12, con distanze molto corte (tipiche delle interazioni idrofobiche; decadono rapidamente all'aumentare della distanza) e stabili. La BDUF si lega poi alla bocca del canale con interazioni ioniche tra i propri glutammati e alcune arginine. Questo legame provoca la divaricazione delle pareti idrofobiche della tasca, e il rilascio della B12 all'interno del canale.

Le proteine ABC degli eucarioti sembrano spesso derivare dalla fusione di più proteine omologhe dei rpocarioti.

Pompa del Ca++ nel RE del muscolo (SERCA): il calcio è presente nel citoplasma a bassissima concentrazione, e questo rende necessario ai suoi trasportatori di avere alte affinità.

E' una pompa ATPasica di classe P (usano l'ATP per autofosforilarsi durante il ciclo; una è la pompa del calcio del RE, un'altra è la pompa sodio-potassio, e l'ultima è la pompa protonica gastrica), che trasporta due ioni per ogni ATP. Nella conformazione E1 è in grado di legare l'ATP e il Mg++ (come cofattore) solo dopo aver legato il calcio. L'idrolisi dell'ATP e la conseguente autofosforilazione porta l'enzima nella forma E2, diminuisce l'affinità per il Ca++ e lo ione viene rilasciato sul lato opposto a quello dell'ingresso. Solo quando il calcio è stato rilasciato l'acqua può entrare per idrolizzare il fosfato e permettere il rilascio del Mg++ e il ritorno spontaneo alla forma E1. Nella forma E2 la pompa riporta anche indietro alcuni protoni (almeno tre), scambiati coi calci durante la transizione E1 --> E2 (per stabilizzare le cariche negative del sito di legame del calcio, estremamente sfavorite in un ambiente così idrofobico come il centro di un canale transmembrana), che compensano almeno parzialmente il movimento di carica prodotto dallo spostamento del Ca++.

SERCA di coniglio: sito di legame del calcio formato da quattro eliche del canale; nell'elica 4 un tratto è non strutturato per permettere l'alloggiamento dello ione. Nella forma E1 il dominio extramembrana è molto divaricato e il passaggio per il calcio è aperto. Il legame del calcio è necessario a produrre questa divaricazione, che permette l'ingresso dell'ATP nel sito catalitico. Il dominio P extramembrana contiene un aspartato fosforilabile, il dominio N  lega l'ATP e il dominio A (attuatore) è necessario al trasporto (mutazioni qui aboliscono la funzione).

I due ioni calcio sono complessati e neutralizzati da quattro carbossili, disposti a una distanza precisa, selettiva per lo ione calcio. Nella conformazione E2 la deformazione delle eliche allontana i carbossili dallo ione e interrompe la coordinazione. Tre eliche parallele al di sotto del dominio A fungono da tiranti molecolari per trasmettere il cambiamento conformazionale alle eliche del canale. La molecola è cristallizzata in presenza di AMP-P-C-P, il cui fosfato in gamma viene avvolto da una struttura proveniente dal dominio N, e la rotazione di quest'ultimo (60°) avvicina l'ATP all'aspartato 351 del dominio P, che fungerà da accettore del fosfato. Contemporaneamente questa rotazione espone sul dominio N una superficie di contatto col dominio A, il quale deforma i tiranti e piega le eliche, che trasmettono questo movimento al canale.

Nel frattempo l'ATP subisce transfosforilazione, dove un ossigeno del carbossile dell'aspartato 351 funge da accettore al posto dell'acqua. La reazione è stata cristallizzata in presenza di ADP e di un potente inibitore delle ATPasi, il fluoruro di alluminio, che simula il fosfato gamma pentacoordinato are dello stato di transizione. La transfosforilazione richiede la presenza di due ioni Mg++ come catalizzatori.

L'acqua di idrolisi per la successiva rimozione del fosfato dall'aspartato 351 viene attivata da un glutammato (parte di una sequenza TGE) collocato sul dominio attuatore, che si avvicina all'aspartil-fosfato solo in seguito a una seconda rotazione della struttura, dovuta al rilascio del Ca++ dal sito di legame, a sua volta dovuto al distanziamento dei carbossili prodotto dal movimento dei tiranti. La deformazione delle eliche tiranti introduce inoltre un'occlusione idrofobica al di sopra del sito di legame del calcio, impedendo il suo ritorno all'indietro, oltre ad aprire le eliche al di sotto dello stesso sito per favorire l'uscita dello ione.

La reazione di idrolisi dell'aspartil-fosfato è stata cristallizzata in presenza del solo alluminio fluoruro (ovviamente l'ADP è già stato rilasciato a questo stadio), e non è poi del tutto chiaro se sia l'assenza di calcio oppure l'assenza di ADP a produrre la seconda necessaria rotazione.

Il dominio A è stabile nella sua seconda conformazione (quella con la TGE vicina all'aspartil-fosfato) grazie alla presenza di uno ione potassio.

La taxidergina inibisce il canale legandosi dal lato interno e bloccandolo nella forma E2, incapace di legare il calcio.

Le ATP sintasi: il processo di sintesi è reversibile in idrolisi, in presenza di un gradiente di protoni opposto.

Nei batteri le otto subunità dell'ATP sintasi sono espresse dallo stesso operone, che contiene anche una nono gene dalla funzione misteriosa (forse una chaperonina).

Il frammento F1 (550.000Da) è formato dalla regione globulare extramembrana, più parte dello stelo (tre coppie alfa-beta, più la gamma stabilizzata da epsilon ed F6, e la delta), mentre FO è il frammento intramembrana (una a, due b che sporgono, nove-dodici c ).

Frammento F1 dell'ATP sintasi del cuore di bue: cristallizzato in presenza di sei AMP-P-N-P, tre legati stabilmente alle subunità alfa al posto dell'ATP, mentre le subunità beta legano una l'ATP, una l'ADP, una soltanto il solfato/fosfato cocristallizzato (cioè è vuota). Gli ATP sulle alfa non scambiano, e la funzione di queste subunità è ancora ignota.

Beta tp (ATP), beta dp (ADP), beta e (vuota) hanno omologia del 70%, e formano con l'alfa adiacente l'unità funzionale, con il sito catalitico all'interfaccia alfa-beta. La subunità beta tp differisce dalla beta dp per la struttura del dominio ad alfa eliche flessibili, che nel primo caso è ruotata verso l'alto, nel secondo verso il basso; questa rotazione (30°), trascina con sé circa la metà del dominio centrale a struttura alfa/beta, che contiene i residui catalitici. Questa non è una deformazione, ma un movimento di due metà rigide attorno a una cerniera.

La subunità gamma si insinua in mezzo al trimero di eterodimeri, e ha una struttura coiled-coil con una regione sporgente che esercita una forza meccanica sul dominio flessibile, determinando la sua posizione in alto o in basso. La rotazione della gamma provoca inoltre l'avvicinamento o l'allontanamento delle subunità alfa e beta tra loro, determinando la larghezza del sito catalitico, e quindi la facilità di entrata/uscita dell'ATP.

Il sito catalitico della subunità beta contiene una Walker A conservata, con un atomo di Mg++ coordinato alla Ser del P-loop e ai fosfati beta e gamma dell'ATP, e una Walker B conservata che immobilizza con un glutammato proprio e uno adiacente (ma condizionato dalla posizione del Walker B) una molecola d'acqua, e con uno dei due la attiva per l'idrolisi.

L'apertura/chiusura del sito catalitico avviene grazie a due anse cerniera, e la divaricazione/restringimento (dovuta allo spostamento della regione flessibile rispetto a quella rigida) allontana o avvicina l'arginin finger proveniente dalla subunità alfa (R373) che ha funzione di accettore del fosfato; inoltre, il P-loop (che è parte della regione mobile) si allontana dal Walker B (parte della regione fissa), mentre l'E188, il più probabile responsabile dell'attivazione dell'acqua, assume una posizione totalmente differente.

Quindi l'apertura/chiusura del sito e la rotazione dei domini flessibile e rigido, causate dalla forza meccanica esercitata dalla subunità gamma, determinano sia lo scambio dei substrati sia l'attività catalitica.

Il frammento FO è formato da una subunità a (forse nove eliche transmembrana), e un cilindro di subunità c (forcina di due eliche estremamente idrofobiche; cristallizzata con NMR in solvente idrofobico o con microscopia a forza atomica) in numero variabile da organismo a organismo, e forse anche all'interno dello stesso; infine un dimero di subunità b protrude fuori dalla membrana in coiled coil e forma lo stelo secondario, responsabile di immobilizzare lo statore.

Le subunità gamma, epsilon (nei batteri), e c formano il rotore della proteina; tutte le altre costituiscono lo statore.

Studi ativi dicono che nelle subunità c è sempre presente un carbossile (da un Asp in Coli), bersaglio di un inibitore universale delle ATP sintasi, il DCCD, capace di bloccare la rotazione (ne basta uno sull'intero anello per ingombrarlo stericamente). L'unico aa conservato nella subunità a è un'Arg. Probabilmente la subunità a interagisce con due subunità c  tramite interazioni ioniche Arg-Asp. Gli altri Asp invece si affacciano verso i lipidi di membrana, una situazione in sé estremamente sfavorevole che richiede la protonazione stabile del carbossile.

Il modello di funzionamento di FO è mutuato da quello per i flagelli dei batteri; le subunità c  ruotano sull'asse per fluttuazione termica, ma in presenza di un gradiente elettrochimico di protoni possono innescare il meccanismo ciclico: un emicanale (affacciato verso l'alto) permette l'uscita dei protoni verso il lato dove sono meno concentrati, lasciando scoperto un Asp (o Glu), che sotto la spinta dellla propria deprotonazione e di quella dell'Asp successivo tenderà a ruotare verso l'altro emicanale (quello affacciato verso il basso) dove potrà ricevere un protone dall'ambiente a maggiore concentrazione e così stabilizzarsi; man mano che la tendenza di una subunità a ruotare spinge tutte le altre, il processo si ripete ciclicamente.

La presenza all'interno delle subunità c di file di amminoacidi polari, capaci di coordinare molecole d'acqua in catena (permettendo la proton chain), sembra sostenere il modello degli emicanali.

La rotazione della subunità gamma è stata dimostrando ingegnerizzando la proteina per rimuovere tutte le cisteine, inserire degli His-tag sull'N-term delle subunità beta per poter poi fissare la proteina su un vetrino, aggiungere una Cis sulla subunità gamma in modo da poterla biotinilare e poter attaccare alla sua estremità un filamento di actina fluorescinata (500 nm, contro un diametro della sintasi di circa 10 nm) legata a streptavidina.

In presenza di ATP e magnesio, alcuni filamenti (il 5-6%) cominciano a ruotare, in senso antiorario.

Diminuendo molto la concentrazione di ATP, la rotazione procede a scatti di 120°, in sintonia con la struttura trimerica della proteina. Con sferette di plastica al posto dell'actina si è riusciti a distinguere lo scatto di 120° in uno di 90° e uno di 30°, probabilmente corrispondente allo stato di transizione.

Circa 180 aa centrali attorno al P-loop della subunità beta sono omologhi a RecA, che ha funzione diversa  ma la medesima necessità di essere flessibile.

Succinato deidrogenasi di E.Coli: codificato da uno dei due operoni della catena respiratoria (l'altro corrisponde alla fumarato reduttasi, una proteina praticamente identica alla succinato deidrogenasi; il fumarato funge da accettore per gli e- provenienti dal NADH o da altre fonti, e si riduce a succinato; la succinato deidrogenasi invece ossida il succinato a fumarato e riduce il menachinone, comune nei batteri adattati a potenziali redox più negativi). Il deltaG tra le coppie succinato/fumarato e menachinone/menachinolo non è sufficiente a fornire energia per la sintesi dell'ATP.

Formata da quattro domini, due transmembrana con tre eliche ciascuno, un dominio di raccordo e uno esterno di forma globulare. Frequente la cocristallizzazione di ioni calcio, che aiutano la stabilizzazione della proteina. Il FAD è legato all'interno della testa globulare, così come l'ossalacetato (omologo del succinato e quindi inibitore dell'enzima). Tre centri ferro-zolfo sono disposti in successione lungo la regione di collegamento. La cardiolipina (difosfatidilglicerolo) si lega nella regione transmembrana, e probabilmente svolge un ruolo importante nella struttura della proteina. Un gruppo eme si trova dentro alla regione transmembrana, molto vicino alla faccia esterna. Nella regione transmembrana troviamo cocristallizato un ubichinone (anzichè un menachinone: probabilmente è un artefatto).

L'ossidante primario è il FAD, i cui elettroni passano di centro FeS in centro FeS fino all'eme, che agisce da riducente per l'ossidante finale, l'ubichinone. Due protoni vengono liberati dall'ossidazione del succinato, altri due vengono consumati nella riduzione del chinone; data la vicinanza del gruppo eme alla faccia superiore, non si ha traslocazione di protoni; però l'ubichinone ridotto può essere liberato all'interno della membrana, dove può poi essere coinvolto in altre reazioni di trasporto. La parte superiore della proteina funge da iniettore di elettroni all'interno della membrana, mentre la regione transmembrana è l'accettore.

Il succinato viene orientato in modo che i suoi CH2 vengano affacciati verso i due N con doppio legame del FAD: un CH2 perde un H+, l'altro un H-, si forma un doppio legame e intanto il FAD si riduce. Il FAD è legato covalentemente con un'istidina.

I centri FeS sono comuni nella proteine che operano a potenziali redox abbastanza negativi; qui sono disposti in successione a fare da conduttore di elettroni verso l'eme.

La succinato deidrogenasi contiene un centro 2Fe-2S (i cui ferri sono ulteriormente legati a cisteine e un carbossile), un centro 4Fe-4S (anche qui coordinati da Cis sulla proteina), e infine un centro 3Fe-4S. Indipendentemente dal numero di Fe, ogni centro accetta e trasporta un solo elettrone alla volta.

L'eme (tipo B) è vicino all'ubichinone II, accetta un elettrone per volta col Fe coordinato, e lo trasferisce al chinone; quest'ultimo può accettare protoni solo dalla faccia esterna a causa della sua posizione.

L'eme B si trova all'interno delle eliche della proteina in disposizione verticale, e con due His provenienti da eliche diverse che legano assialmente il Fe con i loro imidazoli (che assieme ai quattro azoti pirrolici dell'eme completano la coordinazione esavalente del ferro).

La succinato deidrogenasi funziona in trimero.

Nitrato reduttasi di E.Coli: riduce il nitrato a nitrito e ossida il menachinolo a menachinone. Forma di respirazione anaerobia accoppiata alla membrana con sintesi di ATP.

Presenta un fascio di eliche transmembrana con due eme, quattro centri FeS nella regione di connessione, più un altro centro FeS e un gruppo terminale riducente nella regione globulare.

Svolge la funzione di eiettore di elettroni verso l'esterno.

Il gruppo prostetico riducente è un composto del molibdeno (relativamente comuni nei batteri, coinvolti nell'ossidoriduzione di composti 'strani', es: idrocarburi), in cui lo ione è coordinato da quattro solfuri provenienti da due MGD (molibdopteridinguanindinucleotide). Gli elettroni provengono dal menachinone attraverso i due eme e i centri FeS, e il Mo-bis-MGD riduce il nitrato a nitrito e acqua.

I due eme B sono disposti in coppia, coordinati da His e abbastanza ruotati l'uno rispetto all'altro (questa conurazione [citocromo di-eme] rappresenta l'apparato universale di trasferimento degli e- attraverso le membrane). La vicinanza tra gli orli dei due anelli (5 Å) permette un trasferimento estremamente veloce di elettroni.

Il chinone funge da donatore degli elettroni, uno alla volta, che vengono trasferiti verso l'alto attraverso i due eme. Questa volta l'eme accettore degli e- si trova vicino alla faccia inferiore della membrana, per cui  gli H+ del chinone vengono liberati sul lato opposto rispetto a dove vengono consumati i due necessari alla riduzione del nitrato a nitrito+acqua.

Formiato deidrogenasi di E.Coli: il formiato (HCOO-) deriva per decarbossilazione non ossidativa dal piruvato.

Sempre struttura con fascio di eliche transmembrana con due eme, regione di collegamento con quattro centri FeS, più un dominio extramembrana con un altro centro FeS e un centro a molibdeno. In questo caso, essendo il potenziale della coppia formiato/CO- più negativo di quello della chinone/chinolo, gli elettroni fluiranno dal primo al secondo,a differenza di quanto avveniva tra nitrato/nitrito e chinolo/chinone.

Questo è un iniettore di elettroni, dal molibdeno ai centri FeS fino agli eme e infine al chinone, che si riduce a chinolo. Data la vicinanza del'eme riducente alla faccia inferiore, i protoni vengono consumati su un lato e liberati sull'altro.

Anche la formiato deidrogenasi agisce come trimero, anche se probabilmente non c'è interazione funzionale tra le subunità.

Dato che la formiato deidrogenasi    è orientata con il dominio globulare verso l'esterno (periplasma) e consuma H+ sul lato interno per ridurre il chinone, mentre la nitrato reduttasi si affaccia verso l'interno (citoplasma) e rilascia H+ sul lato periplasmatico ossidando il chinolo, allora l'accoppiamento dei due enzimi produce un movimento di protoni netto attraverso la membrana tramite un intermedio chinone/chinolo, e genera un gradiente protonico transmembrana, la cui dissipazione può essere impiegata per la sintesi di ATP.

Complessi BC1: un esempio è il complesso III della respirazione mitocondriale o il complesso I batterico (meno definito). Esistono più strutture del complesso III mitocondriale (lievito, bue, pollo).

Un chinone, per funzionare in vitro, deve avere almeno 3 unità isoprenoidi (Q3); il chinone dei mitocondri di mammifero è Q10, nei lieviti Q6. Nei cloroplasti il plastochinone è Q9.

La riduzione di uno dei due ossigeni col doppio legame rende l'anello aromatico; la riduzione anche dell'altro porta al chinolo (un paradifenolo).

Se il potenziale redox della prima reazione di riduzione è diverso dal potenziale della seconda, allora il potenziale totale della reazione da chinone a chinolo è la media dei due potenziali (vedi Legge di Nernst sulle slides).

Un semichinone è distinguibile dal chinone o dal chinolo spettralmente, però la sua concentrazione all'equilibrio è troppo bassa a causa dell'instabilità del radicale per poterlo vedere allo spettrofotometro (l'instabilità del semichinone lo porta facilmente a dismutare producendo un chinone e un chinolo); di solito si usa la risonanza paramagnetica dell'elettrone (tecnica principe per i radicali). I due potenziali delle reazioni di dismutazione differiscono dalla media di un valore dipendente dal ln della K di stabilità; pertanto più la K sarà piccola (minore di 1), più il suo logaritmo si allontanerà da zero e si allargherà il divario tra i due potenziali. La donazione di un elettrone da parte di un semichinone stabile (cioè incapace di interagire con un altro semichinone per dismutare, in quanto è trattenuto da una proteina) è facile perchè genera un riducente più debole. Al contrario per strappare il primo elettrone dal chinone è necessario un ossidante molto forte, e un sito che leghi il chinone con bassa stabilità per favorire il processo.

Chinolo-accettore ossidoreduttasi (o complesso III) di lievito: le subunità fondamentali sono un citocromo c1 (formato da un singolo eme), un citocromo b (due eme) e una proteina contenente un centro 2Fe-2S (proteina di Rieske). La proteina agisce come un dimero per tutte e tre le subunità. La proteina di Rieske di ogni monomero interagisce con la coda sul proprio citocromo b e con la testa sul proprio citocromo c1. Un'elica transmembrana ancora fra loro le due proteine di Rieske.

La proteina ossida il chinolo e riduce il citocromo c solubile; l'anello porfirinico di quest'ultimo si trova a meno di 4 Å dall'eme del citocromo c1. Invece la proteina di Rieske si trova a più di 26 Å dal c1, una distanza troppo grande per un rapido trasferimento (teoria di Markus: energia libera e distanza dentro la proteina ed energia di riorganizzazione sono i fattori fondamentali per il trasferimento; oltre i 12-l4 Å il trasferimento è irrealistico). Ma la distanza tra la proteina di Rieske e la stigmatellina (analogo dell'ubichinone) è circa 6 Å, a metà strada fra l'eme b-L e la proteina di Rieske. La distanza tra l'eme b-L e l'eme b-H è di circa 10 Å. Quindi uno degli elettroni provenienti dal chinolo va alla Rieske (nel sito Qo), che una volt ridotta lascia il sito e contatta il c1, in modo che l'e- raggiunga il citocromo c solubile; l'altro va al citocromo b-L (sito Qo ) e da lì al b-H (sito Qi ), che riduce un semichinone. L'energia per il trasferimento del secondo elettrone verso il b-H è fornita dal trasferimento del primo verso il c1, termodinamicamente molto più favorito (la Rieske è un ossidante molto più forte, capace di strappare il primo elettrone e fornire l'energia anche per l'altro, mentre il b-H è un ossidante debole, che anzi nei confronti del semichinone stabilizzato nel sito Qo si comporta da riducente).

Quando si forma il semichinone nel sito Qo si liberano due protoni (infatti l'OH del semichinone non è protonato al pH fisiologico), e due protoni devono venire consumati nel sito Qi quando il semichinone riceve i due elettroni necessari a diventare chinolo; a causa della collocazione dei due siti sulle facce opposte della membrana, il processo genera un trasferimento netto di protoni.

La proteina presenta due siti di interazione col chinone a differente affinità (e quindi stabilità): Qo e Qi

I citocromi b sono caratterizzati dalla ferroporfirina (eme b) che caratterizza anche l'emoglobina; la coordinazione del ferro avviene tramite due His.

Il citocromo c solubile è una piccola proteina con una tasca contenente un eme c, nel quale, a differenza del b, i due gruppi vinile sono coinvolti in una reazione di tioeterificazione con due Cis della proteina.

Il citocromo c1 ha una testa globulare analoga alla struttura del c solubile, contenente un eme c; un'elica transmembrana ancora il cyt c1 (che sporge dalla membrana) al fascio di eliche contenente i cyt b. La coordinazione del Fe avviene tramite una His e una Met.

La proteina di Rieske contiene un centro 2Fe-2S all'interno di una testa globulare, ed è ancorata alla mebrana tramite un'elica idrofobica. L'eccessiva distanza misurata tra proteina di Rieske e il c1 viene spiegata con il cambiamento conformazionale a cui la proteina andrebbe incontro tra lo stato ossidato e quello ridotto; l'essere lontana dal cyt c1 permetterebbe di rendere assolutamente irreversibile la reazione. Solo nella forma ridotta può contattare il c1 e cedere l'elettrone, mentre il semichinone lascia il sito Qo e le permette di ridiscendere nella forma ossidata, pronta per la seconda metà del ciclo. Esperimenti di mutagenesi sulla sequenza di una regione non strutturata e quindi flessibile all'interno del linker vicino alla testa sembrano sostenere il modello; non è però chiaro da dove provenga la forza capace di generare il cambiamento.

La proteina di Rieske, a differenza delle altre proteine FeS, ha un potenziale redox molto positivo, dovuto alla coordinazione del FeS tramite due Cis e due His.

Complesso B6F (analogo batterico fotosintetico del bc1) di un battere: contiene una Rieske trasversale tra un cyt b6, e un cyt f.

Il citocromo b6 è composto di due proteine, a formare un fascio di otto eliche transmembrana contenente un eme b-L, un eme b-H e un eme X adiacente al b-H; l'eme X è una protoporfirina IX come gli eme b, ma dotata di un solo vinile, che effettua un legame tioetereo con una Cis.

Il citocromo f è un cyt c inizialmente localizzato nelle foglie (da cui il nome).

Il B6F è coinvolto sia nella fotofosforilazione ciclica (senza evoluzione di O2) sia nella non ciclica (con evoluzione di O2), come pompa protonica per la creazione del gradiente di H+. Nella ciclica la ferredossina potrebbe ridurre proprio l'eme X (la cui posizione verso lo stroma, vicino al b-H, è compatibile con la teoria) e reimmettere gli e- nel circolo, alimentando la pompa protonica senza condurre alla formazione di NADPH né di O2.

Alcuni osservano che la distanza reciproca tra i due b-L (e anche i due b-H) delle subunità del dimero permetterebbe una cooperazione nel trasferimento degli elettroni (es: provengono da un monomero e si incanalano sull'altro).

Oltre all globina e ai citocromi, molte proteine come perossidasi e catalasi contengono gruppi eme.

Come tutte le porfirine, i citocromi hanno tre bande di assorbimento (alfa, beta e gamma) grazie alle quali furono scoperti: una banda a circa 600, una a circa 560, e una a circa 550. La differenza di assorbimento è data dalla presenza dei diversi eme (a, b e c) nei citocromi.

La struttura dell'eme b comprende quattro anelli pirrolici, due residui carbossilati, due gruppi vinilici e quattro metili. I C che condensano anelli pirrolici adiacenti presentano doppi legami, come gli anelli stessi e i vinili; sono tutti doppi legami alternati a legami semplici (coniugati), e conferiscono aromaticità all'intera struttura, che comprende anche gli orbitali periferici del Fe coordinato.

L'eme a è legato a un farnesile (quattro gruppi isoprenici), e inoltre uno dei metili è sostituito da un formile, che aggiunge un doppio legame coniugato.

L'eme c invece è identico al b, eccetto che vicino a ogni gruppo vinile c'è una cisteina con cui si forma un tioetere (due doppi legami in meno).

Normalmente, maggiore è il numero dei doppi legami coniugati più lo spettro si sposta verso il rosso; infatti, negli eme a si trovano più doppi legami che nei b, e a loro volta ne hanno di più dei c. Inoltre, i citocromi a e c hanno potenziale redox più positivo dei b.

Ossidasi terminale della catena respiratoria: cede 4 e- a due ossigeni e consuma 4 protoni, tutto per generare due molecole di acqua. Gli elettroni possono provenire da proteine (es: citocromo c) o coenzimi chinonici.

Nella riduzione dell'ossigeno l'eme coordina sempre un atomo di rame (centro binucleare).

L'uso dell'ossigeno come ossidante ha una resa energetica superiore rispetto all'uso del nitrato o del solfato, a causa del suo potenziale redox molto più positivo; ma la riduzione dell'ossigeno produce anche le ROS, ad esempio a causa di un'ossidasi difettosa.

Citocromo c ossidasi di Paracoccus Dendriticus (?) : considerato un modello batterico della catena respiratoria. Tetramero di quattro subunità codificate da un unico operone, cristallizzato per immobilizzazione tramite anticorpi.

Le subunità 3 e 4 non sono rilevanti per il meccansimo di ossidoriduzione (e hanno funzione ignota).

Le subunità 1 e 2 sono ancorate ai lipidi di membrana e contengono: due emi di tipo a (a  e a3 ) legati non covalentemente anche grazie alla coda di farnesile; due atomi di rame che formano un sito rame-A in alto, più un terzo nel sito rame-B accanto alll'eme a3 , che insieme ad esso costituisce il centro binucleare. Gli e- entrano uno alla volta proveniendo dal cyt c, passano per il rame-A, vanno sull'eme a, da lì all'eme a3 e infine sul rame C.

La distanza tra l'eme a e il rame-A è 15 Å (proprio al limite, ma il trasferimento può essere aiutato da alcuni aa aromatici), mentre la distanza tra i due eme è meno di 8 Å; infine, la distanza tra l'eme a3 e il rame-B è solo di 5 Å, ottimale perché la molecola di O2 possa intercalarsi tra i due ioni coordinandosi con un atomo sul ferro e con l'altro sul rame.

Il Fe dell'eme a3 ha solo cinque legami, non sei, in modo da essere libero per accettare l'ossigeno.

Il più importante inibitore della citocromo ossidasi è il CN-, capace di legarsi nello spazio tra i due ioni in competizione con l'ossigeno (oppure azide N3, o CO).

La citocromo ossidasi copre la distanza tra i -220 mV del cyt c e i +800 mV della coppia ossigeno/acqua, la più grande del ciclo respiratorio; questo la rende una buona pompa protonica. 4 H+ (scalari) vengono consumati nel citoplasma per produrre acqua ogni 4 e- trasportati, e in più ogni elettrone produce la traslocazione diretta di un protone verso l'esterno, secondo un percorso non definito; però le eliche trasmembrana della subunità 1 si organizzano in gruppi di quattro a formare un totale di tre pori: uno è occluso dall'eme a3, un altro dall'eme a, e l'ultimo è libero; per di più, pur essendo transmembrana è costellato di aa polari, permettendo in teoria la formazione di un proton wire (inoltre, mutazioni negli aa polari del canale sembrano abolire l'attvità di pomgio dei protoni).

La subunità 2 contiene il rame-A (i due eme e il rame-B sono nella 1), coordinato tramite cisteine; la struttura è quella tipica delle proteine-rame (simile alla Rieske): un barile beta con una forcina di due eliche all'N-term che ancorano la proteina al complesso. I due atomi di rame sono posizionati a ponte tra due cisteine.

Il Fe dell'eme a è comare rispetto all'anello, mentre nell'eme a3 è fuori asse, come nell'emoglobina, ed è coordinato solo dall'His 411, che lascia un legame disponibile.

Il rame-B è coordinato da quattro His e un quinto legame.

La citocromo ossidasi di mitocondrio di cuore di bue è composta da 13 subunità ripetute in dimero (anche se forse questo è un artefatto), ma nelle parti essenziali è identica alla cyt c ossdiasi procariotica: le subunità 1 e 2 presentano la medesima struttura che in Paracoccus .

Esistono citocromo ossidasi che sostituiscono uno o entrambi gli eme a con eme b, o con eme di tipi più rari, come i µ; non sono noti casi di cyt ossidasi contenenti eme c.

Il sito bimetallico è capace di trattenere stabilmente gli intermedi di riduzione dell'ossigeno, grazie alla presenza di rame e ferro, metalli di transizione che possiedono più stati di ossidazione.

I primi due e- riducono i due centri metallici (da I a II entrambi), che poi li cedono all'ossigeno trasformandolo in un perossido legato; il terzo elettrone genera un perossido protonato che si sposta sul rame generando una molecola d'acqua legata, mentre l'altro ossigeno della molecola forma doppio legame col Fe, che passa a un stato ancora più ridotto (III); l'ultimo elettrone protona questo ossigeno, portando il Fe a (II), e infine i due OH- vengono liberati per protonazione, generando due H2O e ossidando nuovamente gli ioni allo stato (I).

Le chinolo ossidasi hanno lo stesso centro bimetallico delle citocromo ossidasi, ma hanno il menachinolo o l'ubchinolo come riducenti lipofilici.

Ubichinolo ossidasi di E.Coli: due ubichinoli (tipicamente provenienti dalla NADH deidrogenasi) vengono ossidati a due ubichinoni, e una molecola di ossigeno viene ridotta a due molecole d'acqua.

La struttura è indentica a quella già vista, la subunità 1 contiene gli eme (un b e un a3) e il rame-B, mentre la 2 presenta una testa e una coda transmembrana, ma non contiene il rame-A (infatti è priva di cisteine che lo coordinino); questo è coerente con la lipofilicità del donatore, che essendo all'interno della membrana non necessita di un sito di legame esterno. Il sito di ossidazione del chinolo non è ben mappato, ma ha senso che sia vicino al cyt b, in analogia col sito Qo del complesso III.

Clorofille: porfirine, spettro tipico, molte somiglianze strutturali con gli eme.

Hanno un residuo R4 legato al carbossile del propionato. La coda di geranil-geranile (quattro unità isopreniche) o di fitile (identico al precedente, ma con tre doppi legami idrogenati) le ancora alle proteine di cui fanno parte.

L'acqua atmosferica assorbe sopra i 1000 Å, cioè nell'infrarosso, mentre l'ozono assorbe l'ultravioletto.

Alcuni rari microrganismi possono esere sussidariamente fotoautrofi senza essere propriamente fotosintetici, come gli alobatteri.

Batteriorodopsina di Alobacterium Salinarum: struttura molto simile ai recettori a sette eliche eucariotici, in particolare alle rodopsine. Contiene una molecola di retinale, derivata dalla vitamina A. Pompa protonica fotochimica ma con meccanismo diverso da quello fotosintetico, e usata soltanto in condizioni di carenza di ossigeno.

La proteina non presenta alcun genere di canale, ma piuttosto un percorso di aa polari transmembrana che permette l'organizzazione di una proton chain. Questo percorso è interrotto dal retinale, legato con un legame imminico alla Lys 216 (base di Schiff protonata). L'espulsione dei protoni dalla cellula è controllata dalla fotoisomerizzazione torsionale del retinale da trans a cis attorno a un doppio legame; il legame nella base di Schiff abbassa l'energia di attivazione di questa transizione.

La posizione della coda del retinale cambia avvicinando il protone della base di Schiff all'Asp 85, che si protona e trasferisce il movimento di carica alla seconda metà della proton chain; intanto la base di Schiff viene riprotonata ricevendo un H+ dall'Asp 86 (l'ultimo elemento della proton chain superiore) e il retinale ritorna in trans.

Altre rodopsine nello stesso battere (alorodopsina) trasportano invece ioni Cl-, oppure mediano la fototassi (sensorodopsina).

La vera fotosintesi non è soltanto un sistema di pomgio protoni, ma una reazione di ossidoriduzione innescata da fotoni (nei rodobatteri: la clorofilla eccitata si ionizza e cede il proprio elettrone eccitato a un vicino accettore, ritornando nello stato fondamentale come catione; una catena di accettori secondari, terziari eccetera a energia sempre minore, e sempre più distanti dalla clorofilla, impedisce che l'e- possa mai tornare indietro, portando a un rendimento quantico di 1; l'accettore finale è il chinone, che passa a chinolo; attraverso l'ossidazione del chinolo ad opera del cyt bc1 l'elettrone ritorna verso la clorofilla, dove neutralizza la carica cationica).

Centro di reazione fotosintetico di Rodopseudomonas Spheroides: proteina anfipatica formata da tre subunità L, M, H (in base al peso molecolare).

M ed L, omologhe al punto da essere sicuramente derivate dallo stesso gene ancestrale, formano un fascio di dieci eliche transmembrana, mentre la H è extramembrana ed ancorata alle altre due tramite un'elica N-term.

I pigmenti sono localizzati metà nella subunità L e metà nella M, e si distinguono in braccio A e braccio B; comprendono due molecole di batterioclorofilla a, sovrapposte in dimero a formare il P870; altre due batterioclorofile a (primo accettore); due molecole di batteriofeofitina (batterioclorofilla priva di Mg++ centrale; secondo accettore); e infine due UQ10 (QA riceve l'e- dalla feofitina e lo passa a QB, che è l'accettore finale); un atomo di Fe nella stessa regione stabilizza la proteina legando quattro His, a due delle quali sono ancorati i chinoni.

Una volta completamente ridotto a chinolo, il chinone nel sito QB può essere scambiato verso l'esterno con un nuovo chinone, mentre il chinone in QA è stabilmente legato e sepolto nella struttura della proteina.

Il chinolo liberato dal sito QA può migrare attraverso la membrana fino al cyt bc1, nel cui sito Qo verrà ossidato per pompare protoni verso il periplasma; gli e- del chinolo ossidato vengono invece riportati attraverso un cyt solubile fino al centro di reazione.

La velocità di trasferimento tra P870 e le batterioclorofille/batteriofeofitine è nell'ordine dei femtosecondi.

Pigmenti antenna procariotici (es. LH2 dei batteri rossi): otto eliche alfa di una proteina più altre otto beta provenienti da un'altra proteina, assemblate in dimeri contenenti tre clorofille e un carotenoide ciascuno, disposti a formare un canale. Le distanze tra le subunità permettono trasferimenti di energia tra un pigmento e l'altro nell'ordine dei femtosecondi (delocalizzazione efficientissima).

Le LH1, che circondano la clorofilla del centro di reazione, sono fatte di 16 dimeri, e contattano le LH2 con le estremità del cerchio.

Le antenne delle piante sono molto diverse.

Fotosintesi ossigenica: il fotosistema II è connesso con il fotosistema I tramite il BF6, che ossida un plastochinolo. L'intero sistema ossida un molecola a potenziale molto positivo (l'acqua) a riduce una a molecola molto negativa (NADP+). E' l'esatto inverso della respirazione ossidativa.

L'energia del fotone (1,14 eV) è troppa perché un solo fotosistema possa generare un rendimento quantico alto; da cui i due fotosistemi.

Il P680 è un dimero di clorofille a, che nella forma cationica è così positivo da poter ossidare l'acqua; reagisce violentemente anche con se stesso, e il componente più interno del centro di reazione (proteina D1) ha un turnover velocissimo.

Fotosistema II di cianobattere: dimero la cui subinità costituiscono un fascio di alfa eliche, più due domini extramembrana che sporgono nel lume tilacoidale.

All'interno di ogni monomero si trovano due clorofille a (il P680), due feofitine a, un plastochinone nel sito QA e uno nel sito QB (non mostrato nel cristallo), più un Fe che stabilizza la proteina. Infine, un centro multimetallico a Mn costituisce il sito di evoluzione dell'ossigeno. La Tyr92 può fungere da trasportatore di elettroni diventando un radicale tirosinico.

Il P680 presenta le clorofille più distanziate rispetto al P870, e questo potrebbe giustificare il suo potenziale redox più positivo.

La resa di O2, al crescere del numero dei lampi di luce somministrati (abbastanza brevi da permettere una sola eccitazione fotochimica), ha dai picchi con una periodicità di 4 lampi. Significa che sono necessari 4 fotoni per ossidare una molecola d'acqua.

Il cluster di Mn contiene solitamente quattro manganesi ridotti (III): ogni fotone causa il passaggio del P680 alla forma cationica, che strappa un elettrone a uno dei Mn e lo ossida a (IV), finchè tutti e quattro non sono ossidati e si rigenerano operando l'ossidazione dell'acqua.

Sono disposti in due coppie leggermente allontanate, come un cubo stiracchiato (ai raggi X).

I monomeri contengono anche una quantità di clorofille antenna.

Fotosistema I di cianobattere: non contiene ubi- o plasto-chinoni nella cascata accettrice perché non avrebbero potenziale abbastanza negativo per ridurre il NADP+; piuttosto usa dei centri FeS.

E' un dimero con un fascio di eliche trasmembrana, un piccolo dominio extramembrana e molte clorofille all'interno. Due clorofille a sovrapposte, sfalsate e parallele formano il P700, con vicino due coppie di clorofille intermedi del trasferimento; poi due fillochinoni (ospitati in due siti stabilmente legati, ciascuno corrispondente a un sito QA), che essendo naftochinoni hanno potenziale più negativo degli altri chinoni; infine i tre centri FeS (Fe-X, Fe-A, Fe-B). Questi passano l'elettrone alla ferredossina, che poi funge da substrato alla ferredossina-NADP+ reduttasi (una flavoproteina) per la riduzione del NADP+.

I pigmenti antenna costituscono la maggior parte dei 127 gruppi prostetici che circondano il centro di reazione, e formano un cerchio continuo che prende contatto col centro vero e proprio tramite due clorofille antenna; i punti di contatto e l'estrema vicinanza tra le clorofille e i carotenoidi permettono la proazione dello stato eccitato attraverso tutta la struttura (delocalizzazione dell'eccitone).

I cloroplasti contengono ATP sintasi intercalata nelle membrane dei tilacoidi. L'orientamento dei centri PSII e PSI trasferisce gli elettroni dall'interno delle membrane tilacodi verso il lume dello stroma, mentre i protoni vengono consumati sul lato stromale ed evoluti sul lato intratilacoidale, che quindi costituisce il deposito degli H+. La dissipazione del gradiente protonico verso l'esterno permette la sintesi di ATP.

La ferredossina (oltre a permettere la fotofosforilazione ciclica) funge anche da switch fotosensibile per l'attivazione o disattivazione di altri enzimi metabolici (es: ciclo di Calvin), in quanto una volta ridotta riduce a sua volta la tioredossina, che agisce da riducente generalizzato per la rottura di ponti disolfuro in molti enzimi metabolici.