CROMATOGRAFIA - separazione di miscele di sostanze tramite la cromatografia

CROMATOGRAFIA

SCOPO: separazione di miscele di sostanze tramite la cromatografia.

MATERIALI: carta per cromatografia;

lastre al gel di silice o per TLC;

becher;

matita;

etanolo C2H5OH;
acetone C3H6O;

aminoacidi (prolina, leucina, fenil-alanina, acido aspartico);

ninidrina (metanolo + acido acetico);

normal-butanolo;

capillare;

nebulizzatore;

acqua deionizzata;

ossido di magnesio (MgO);

celite;

foglie di spinaci;

piastra riscaldante;

benzina;

benzene;

metanolo;

cicloesano;

etere di petrolio;

supporto fisso;

provetta;

bicchiere;

parafilm;

1°PROCEDIMENTO: CROMATOGRAFIA SU CARTA

Per effettuare l'esperienza si prende la striscia di carta per cromatografia la quale è costituita da una particolare cellulosa, a circa 1cm da un'estremità si traccia la linea di base con una matita (la graffite non influisce con la prova). Sulla linea di base si seminano una seria di punti o linee, nel nostro caso, di inchiostro.

Si prepara il recipiente per la cromatografia, nel bicchiere si versa dell'eluente (Etanolo) (circa 5mm), si tappa il bicchiere e si aspetta qualche minuto finchè l'interno si satura di vapore. Si prende la striscia di carta per cromatografia su cui si è seminato e si mette  nel recipiente in modo che per fenomeno di capillarità il solvente incomincerà a imbibire la striscia di carta: arrivato all'altezza della miscela trascinerà i singoli componenti nel suo movimento con una velocità di migrazione proporzionale al coefficiente di ripartizione fra solvente organico e fase acquosa.

Si lascia migrare il solvente lungo la carta sino a che è giunto a 1 cm dal bordo superiore, a questo punto si toglie la carta e prima che si asciughi si segna con la matita il fronte del solvente e la si mette ad asciugare.

Dopo essiccamento si possono notare varie macchie colorate corrispondenti ognuna ad un componente della miscela iniziale.

Non sempre le sostanze in esame sono colorate; in alcuni casi occorre, a cromatografia ultimata, spruzzare la carta con opportune sostanze (per es. la ninidrina per gli aminoacidi), che reagiscano con i componenti della miscela colorandoli ed evidenziando così le macchie originariamente incolori. Le macchie si possono localizzare anche esponendo la carta a luce ultravioletta.

Un pregio della cromatografia su carta è che sono sufficienti piccolissime quantità dei singoli componenti. 

2°PROCEDIMENTO: CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE

E' una tecnica del tutto analoga a quella precedente, solo che al posto della striscia di carta per cromatografia si usano apposite lastre di vetro (in certi casi anche alluminio) ricoperte di un sottile strato di sostanza porosa come la silice.

Con questa tecnica abbiamo inizialmente rifatto una semina di inchiostro mentre la seconda fase è consistita nella separazione di quattro aminoacidi disciolti in acqua in concentrazione di 0,5%.

Questi aminoacidi sono la prolina, la leucina, la fenil-alanina e l'acido aspartico.

Analogamente a prima si è preparato il recipiente per la cromatografia: nel bicchiere si versa l'eluente composto da normal-butanolo, acido acetico e acqua secondo rapporto 60:20:20 in volume. Si tappa il bicchiere e si aspetta qualche minuto finchè l'interno si satura di vapore. Si prende la lastra per TLC su cui sono stati seminati tramite un capillare i 4 aminoacidi e si mette  nel recipiente in modo che per lo stesso fenomeno descritto precedentemente nella tecnica di cromatografia su carta si formeranno delle bande, questa volta però incolori essendo incolori anche le soluzioni iniziali.

E' stata quindi spruzzata la lastra con la ninidrina (metanolo + acido acetico) una sostanza opportuna che reagisce con i componenti della miscela colorandoli ed evidenziando così le macchie originariamente incolori.

Per l'opportuno riconoscimento degli aminoacidi è stato utilizzato anche l'Rf che corrisponde al rapporto tra fronte o altezza della macchia e altezza del solvente avendo ogni aminoacido un proprio Rf teorico.

Oltre agli aminoacidi abbiamo provato a separare i pigmenti degli spinaci con il diluente composto da cicloesano, acetone e etere in rapporto 2:1:1 in volume.

3°PROCEDIMENTO: CROMATOGRAFIA SU COLONNA

Tramite questa tecnica abbiamo cercato di separare i pigmenti di un estratto di foglie di spinaci: clorofilla a e b, xantofilla e caroteni.

Si utilizza una colonna di vetro, munita di rubinetto all'estremità inferiore e riempita della fase stazionaria costituita da celite e ossido di magnesio.

Il materiale adsorbente viene, invece, introdotto nel tubo cromatografico sotto forma di sospensione nel solvente che verrà poi usato per la cromatografia. L'assestamento del solido si facilita applicando all'uscita inferiore della colonna una leggera aspirazione avendo, però, cura che il solido stesso rimanga in ogni momento ricoperto dal solvente. Si introducono, così, altre piccole quantità di adsorbente, fino a che la colonna abbia raggiunto l'altezza voluta. Per evitare la formazione di bolle d'aria in seno alla colonna si può preventivamente riempire il tubo con solvente puro e lasciarvi cadere l'adsorbente, a piccole porzioni, battendo lateralmente il tubo stesso. Prima dell'introduzione della miscela da separare si versa sopra la colonna, che comunque si sarà sempre mantenuta ricoperta dal solvente, un'altra piccola quantità di solvente, che si lascia poi percolare attraverso la colonna fino a quando questa rimane coperta solo da uno strato molto basso di liquido. A questo punto, si introduce cautamente la soluzione della miscela da risolvere. É importante che questa formi sulla colonna una zona di adsorbimento molto ristretta; se la zona è troppo larga, le bande di eluizione devono poi percorrere un cammino maggiore per potersi separare nettamente, e comporta l'uso di colonne di lunghezza eccessiva.

Il solvente impiegato per l'eluizione è assai spesso quello utilizzato per solubilizzare le sostanze da separare.

Mediante un pestello è stata tritata la foglia di spinaci ed al liquido verde ottenuto si sono aggiunti circa 20 ml di estraente composto da benzina, benzene e metanolo. 

Per eliminare l'acqua presente che avrebbe reso poco visibile la separazione dei pigmenti si è fatta bollire la soluzione in modo da farla evaporare e per accelerare l'operazione è stata aggiunta alla soluzione una sostanza anidra: solfato di sodio che, divenuto idrato, è stato eliminato filtrando la soluzione tramite un'apposita carta.

Dopo diverso tempo si è potuta osservare solo un piccolo accenno alla separazione dei pigmenti.

APPROFONDIMENTI

La cromatografia è una tecnica di analisi chimica che consente di separare i vari componenti di una miscela in base alla loro diversa attitudine a distribuirsi fra due fasi (per es. un liquido e un solido adsorbente) dette, rispettivamente fase mobile o eluente e fase stazionaria.

-Meccanismo di separazione. La miscela da separare viene collocata a monte della fase stazionaria (che può essere per es. una colonna verticale riempita di materiale granulare come gel di silice o allumina), attraverso la quale viene fatta scendere in continuazione la fase mobile (per es. un liquido) che trascina con sé i componenti della miscela; questi ultimi vengono adsorbiti (cioè trattenuti attraverso forze di attrazione intermolecolari) dal materiale di riempimento in modo differente, ciò che permette la separazione in sequenza all'uscita della colonna (se i composti sono una serie di bande diversamente colorate dette cromatogramma).

La cromatografia fu inventata nel 1906 dal botanico russo di origine italiana M. Tswett (1872-l919) che la applicò alla separazione di pigmenti di piante, i quali si separavano in bande colorate (da qui il nome di cromatografia cioè scrittura del colore); queste colorazioni, diverse tra loro, permettono di identificare e separare le varie sostanze di una miscela.

Tswett si servì della tecnica di "cromatografia per adsorbimento". Il più elementare dispositivo atto a realizzarla consiste in un tubo di vetro riempito di materiale adsorbente detto "colonna di adsorbimento" e formato da allumina, ossido, idrato o carbonato di calcio, ossido di magnesio, caolino, siliciati complessi, ecc. Attraverso tale strato adsorbente si fa passare con lentezza una soluzione contenente varie sostanze colorate. A causa della loro diversa adsorbibilità, esse si fisseranno a quote diverse sulla colonna adsorbente, formando un certo numero di bande colorate che si chiamano nel loro insieme "cromatogramma". Si toglie quindi dal tubo la colonna di adsorbimento e si separano fra loro le bande colorate. Ognuna di queste zone viene trattata a parte: con adatto solvente si estrae il principio colorato e lo si separa per filtrazione dal materiale di adsorbimento. Queste ultime operazioni, che portano alla separazione e infine all'isolamento delle varie sostanze, si dicono "sviluppo del cromatogramma".

Questo ingegnoso metodo analitico è servito a studiare a fondo molte sostanze naturali e si è rivelato prezioso per la separazione e l'isolamento si molti enzimi e molte vitamine.

Metodi cromatografici.

I metodi cromatografici si distinguono per la diversa natura e geometria dei supporti, oppure per le caratteristiche chimico-fisiche delle fasi, che determinano il tipo di interazioni in gioco. Nella gascromatografia la fase mobile è un gas; nella cromatografia in fase supercritica è ancora un gas, ma a temperatura e pressione tali per cui non può passare allo stato liquido (e per questo possiede caratteristiche per certi versi intermedie fra liquidi e gas); nella cromatografia in fase liquida la fase mobile è un liquido puro o una miscela di liquidi. Per quanto riguarda i meccanismi chimico-fisici, che determinano la distribuzione fra le diverse fasi e in definitiva la separazione, si hanno la cromatografia di adsorbimento, di ripartizione (solubilizzazione differenziale fra due diverse fasi liquide), di scambio ionico (quando la fase stazionaria possiede gruppi attivi dotati delle capacità di scambiare selettivamente determinati ioni), di esclusione (se la fase stazionaria è un solido poroso o un gel, i cui pori possono selezionare le varie molecole in base alla dimensione), di affinità (quando, operando sulle caratteristiche dell'eluente, si rende la fase stazionaria più o meno affine alle molecole da separare).

Applicazioni.

Nell'analisi chimica sono essenzialmente di tipo quantitativo, a meno che la cromatografia non venga accoppiata con altre tecniche (per es. l'associazione con uno spettrometro di massa consente anche il riconoscimento qualitativo dei componenti della miscela). Con la moderna strumentazione è possibile operare su quantità estremamente piccole di sostanza e si possono separare sostanze di ogni genere "risolvendo" (cioè caratterizzando) miscele anche molto complesse. Un'altra importante applicazione interessa, per es., la purificazione dei preparati medicinali. Nella pratica industriale l'impiego maggiore riguarda senz'altro l'addolcimento delle acque: infatti la tecnica che fa uso di resine a scambio ionico per allontanare gli ioni calcio e magnesio è sostanzialmente una cromatografia.