ELETTROFORESI SIEROPROTEICA - analizzare il siero di un'anatra attraverso l'elettroforesi

ELETTROFORESI SIEROPROTEICA

Scopo: analizzare il siero di un'anatra attraverso l'elettroforesi.

Materiale:

siero d'anatra;

alimentatore;

camera elettroforetica con la sostanza tampone all'interno;

pozzetto;

strisce di acetato di cellulosa;

sostanza tampone;

depositore;

ponte;

colorante rosso Ponceau sciolto in acido tricoloracetico;

acido acetico 5%;

diafanizzante (soluzione di 86ml di metano e di 14ml di acido acetico ogni 100ml di soluzione;

recipienti;

vetrino.

Procedimento:

le strisce d'acetato di cellulosa sono state inserite nella sostanza tampone per 2-

3 minuti. Successivamente sono state estratte ed è stata effettuata la semina grazie ad un depositore ed ad un pozzetto. Le strisce sono state fissate ai ponti e questi inseriti per circa 30 minuti nella camera elettroforetica collegata ad un alimentatore impostato sui 200 V.

La striscia è stata tolta e immersa nel colorante rosso Ponceau per circa 10 minuti, immersa più volte in acido acetico decolorante e per circa 5 minuti in diafanizzante. Alla fine la striscia p stata posta su un vetrino e messa in forno per circa 15 minuti a 80°C.

Approfondimenti e conclusioni:

l'elettroforesi consiste nella migrazione di particelle colloidali cariche, sotto l'azione di un campo elettrico; le particelle cariche positivamente si dirigono verso l'elettrodo negativo e quelle con carica negativa verso l'elettrodo positivo. La velocità di migrazione dipende dal numero di cariche presenti su di una particella e ha quindi un valore caratteristico per ciascuna sostanza.

L'elettroforesi è un metodo di analisi chimica usato nel caso di dispersioni colloidali e particolarmente utile per la separazione di sostanze di natura proteica. I primi apparecchi per elettroforesi consistevano schematicamente di un semplice tubo a U nel quale si poneva la soluzione in esame immergendovi quindi due elettrodi; in seguito Arne Tielius ha perfezionato le celle elettroforetiche eliminando alcuni inconvenienti dei precedenti apparecchi. In ogni caso, al passaggio della corrente comincia la migrazione delle particelle e la stratificazione nelle vicinanze di ciascun elettrodo delle diverse sostanze presenti in soluzione. Si deve soprattutto a Tiselius l'affinamento dei metodi per l'analisi qualitativa e quantitativa degli strati che si sono formati al termine di questo processo.

Ultimamente si è sviluppata l'elettroforesi su carta: in questo caso la cella elettroforetica è costituita da una striscia di carta da filtro, le cui estremità pescano in due vaschette contenenti gli elettrodi; sulla carta si pone una goccia della soluzione da analizzare. Al passaggio della corrente i singoli componenti migrano, ciascuno con la propria velocità, e si dispongono a distanze diverse dal punto di partenza. Il risultato finale è una serie di zone che possono essere analizzate sia qualitativamente (con reazioni cromatiche), sia quantitativamente (intensità del colore, area della zona).

Per la separazione elettroforetica sono sufficienti quantità di elettricità piuttosto data la grandezza delle particelle colloidali. Questa tecnica ha dato risultati soddisfacenti per l'analisi delle proteine del plasma, per l'isolamento e la purificazione degli enzimi, di ormoni di natura proteica, ecc. Trova impiego sia per la ricerca scientifica che per la pratica clinica.

Il principio dell'elettroforesi viene sfruttato in biologia e specialmente in medicina per l'analisi delle proteine disciolte nei liquidi organici. In base all'elettroforesi del plasma umano sono state distinte albumine e globuline ?????e????variazioni quantitative e qualitative di queste frazioni caratterizzano alcuni stati morbosi e certe malattie permettendone una diagnosi precisa e di relativamente facile esecuzione. Gli aminoacidi e di conseguenza tutte le proteine sono molecole dotate di cariche elettriche (elettroliti anfoteri) perciò se sono poste in un campo elettrico si sposteranno verso l'elettrodo di segno opposto; e precisamente migreranno verso il catodo le proteine con carica risultante positiva (cationi), mentre verso l'anodo, elettrodo positivo, le proteine con carica negativa (anioni). Gli aminoacidi o le proteine ad un pH inferiore al punto isoelettrico, essendo dissociati come cationi, si dirigono al catodo, invece al pH superiore al punto isoelettrico, essendo dissociati come anioni, migreranno verso l'anodo. Se il pH coincide con il punto isoelettrico la proteina non si sposterà né verso il catodo né verso l'anodo in quanto la carica totale è uguale a zero. L'elettroforesi è un metodo d'indagine utile per separare miscugli d'aminoacidi, proteine e nucleotidi, poiché ognuno di questi composti organici, ad un certo valore del pH possiede una forma, un peso molecolare ed una certa polarità quindi si sposterà con diversa velocità percorrendo determinati spazi sotto l'influsso di un campo elettrico.

In laboratorio abbiamo utilizzato questa tecnica per separare alcune proteine del sangue, tessuto allo stato liquido che circolando nei vasi sanguigni del corpo dei vertebrati assolve la funzione fondamentale di assicurare un collegamento metabolico tra tutti gli organi e tessuti dell'organismo, il sangue può quindi essere considerato come un tessuto connettivo altamente specializzato. Dal punto di vista dell'organizzazione istologica il sangue può essere suddiviso in una parte liquida, detta plasma, e in una parte corpuscolata (cellule del sangue) sospesa nel plasma e che rappresenta più o meno il 43% del volume complessivo. Dal plasma è possibile separare il siero che è la parte liquida priva della parte corpuscolata e del fibrinogeno, una sostanza che insieme alle piastrine è fondamentale per i meccanismi di coagulazione. Il plasma è composto da soprattutto acqua, proteine, sostanze inorganiche come il sodio, potassio, cloruro, carbonato e bicarbonato di calcio, zuccheri, enzimi, grassi, aminoacidi e prodotti di scarto come l'urea e la creatinina. Le principali proteine del plasma comprendono l'albumina la cui funzione principale è il mantenimento della pressione osmotica del sangue; una decina di altre proteine tra cui le agglutinine che provocano la reazione d'agglutinazione tra campioni di sangue di gruppi diversi e una forma di shock allergico chiamato anafilassi; molti tipi di globuline, tra cui gli anticorpi, che assicurano l'immunità contro molte malattie; altre importanti proteine plasmatiche sono deputate al trasporto di nutrienti indispensabili ai tessuti come il rame, ferro, altri metalli e vari ormoni.

È stato preso il siero dell'anatra ottenuto per coagulazione del sangue e seminato su una base fissa che, nel nostro caso, era una striscia d'acetato di cellulosa. Questa carta è stata imbevuta in una sostanza tampone con un pH di 8.8 molto importante per il processo elettroforetico

Il metodo elettroforetico è impiegato anche per la purificazione di alcune proteine speciali, di enzimi, di ormoni proteici, di tossine batteriche, ecc.